Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,775

COMPARATIVE ANALYSIS OF POSITION-FINDING AND EXPLORATORY BEHAVIOR OF RATS WITH ABSENCE EPILEPSY, WHICH ARE DIFFER IN GENOTYPE IN LOCUS TAG 1A GENE RECEPTOR OF DOPAMINE SECOND TYPE (DRD2)

N.F. Leushkina L.B. Kalimullina
In this work firstly describes peculiarities of behavioral reactions in «open field» test of two groups of rats consisted of large number of animals, which are homozygous in locus TAG 1A DRD2. Keywords: The analysis, behaviour of rats, the equipment «open field».

Изучение механизмов взаимодействия организма с факторами внешней среды, выяснение общих и частных механизмов адаптивной деятельности, а также организации простых и сложных форм поведения - актуальная проблема учения о высшей нервной деятельности, которая занимает центральное место в системе нейронаук. Современная нейробиология обладает широким набором методических приемов, позволяющих проследить путь от гена к психологическому признаку (психогенетика), использует разнообразные подходы в анализе поведенческих реакций животных с модификациями структуры гена (генетика поведения) и проводит кропотливые исследования в естественной среде их обитания (этология). В настоящее время синтез физиологии, этологии, нейропсихологии и других направлений нейробиологии необходим для полного понимания высших функций мозга и составляющих его основу нервных процессов, их организации в систему, управляющую поведением организма.

Цель работы - сравнительный анализ характеристик поведения в условиях новизны обстановки двух субпопуляций гомозиготных (А11 и А22) по локусу TAG 1A гена рецептора второго типа крыс линии WAG/Rij в тесте «открытое поле».

Крысы инбредной линии WAG/Rij выведены в питомнике TNO в Нидерландах в ходе многократного (>100 поколений) близкородственного скрещивания крыс линии Вистар. Работами голландских ученых выявлено наличие у данной линии спонтанных несудорожных приступов, по ряду параметров сходных с абсансными припадками, возникающими при абсансной форме несудорожной эпилепсии у человека [14]. На основании поведенческих и электрофизиологических исследований сделан вывод о функциональной недостаточности дофаминэргической системы мозга крыс линии WAG/Rij [12]. Также показано, что у крыс с генотипом A1/A1 по локусу TAG 1A DRD2 имеет место более выраженная спайк-волновая активность по сравнению с крысами А2/А2, что проявляется большей продолжительностью спайк-волновых разрядов на регистрируемой ЭЭГ, при локализации хронических электродов в соматосенсорной коре - основной эпилептогенной зоне [4].

Исследования проведены на 148 половозрелых крысах в возрасте шести месяцев, 83 из которых имели генотип А11, 65 - А22 по указанному локусу DRD2. Животные были выращены из родительских особей, предоставленных профессором Г.Д.Кузнецовой (Институт ВНД, г.Москва) с любезного согласия проф. J.van Luijtelaar и проф. А. Coenen (Dept. of Comparative and Physiological Psychology, NICI, KUN, Nijmigen, The Netherlands). Родительские особи для получения двух изученных субпопуляций крыс линии WAG/Rij были выявлены после генетического анализа указанного локуса DRD2 в исходной популяции крыс, проведенного под руководством профессора, доктора биологических наук Э.К. Хуснутдиновой [1]. В работе крысы с генотипом А11 обозначены как группа А1А1, с генотипом А22 - А2А2. Животных содержали по пять особей в стандартных проволочных клетках, где они могли свободно передвигаться, имея неограниченный доступ к воде и пище. Температура в помещении поддерживалась в пределах 20-22°С, продолжительность светового дня составляла 14 часов. Эксперименты проводили на небольших группах крыс в различные сезоны года (зима, весна, лето).

Изучение поведения крыс проводили в установке «открытое поле» (ОП) в течение 10 дней. Использованная в работе установка ОП представляла собой квадратное открытое пространство (арену площадью 100 квадратных сантиметров), огороженное стенкой. Пол арены был расчерчен на 16 квадратов одинаковой площади, из которых четыре располагались в центре, а 12 были периферическими. Над центральными квадратами поля располагалась лампа в 60В, с помощью которой достигалась разница в освещенности центральных и периферических квадратов.

Животное помещали на арену и в течение 5 минут регистрировали 11 параметров поведения: 1. Число пересеченных квадратов (амбуляций) в центре ОП. Квадрат считали посещенным, если животное пересекало его границу обеими передними лапами; 2. Число пересеченных квадратов на периферии ОП; 3. Сумма количества амбуляций в центре и на периферии ОП характеризовала общую двигательную активность крысы; 4. Количество вертикальных стоек в центре ОП. При этом животное отрывало передние лапы от пола, и поднимало свое тело на задних лапах, вытягивало шею, часто поворачивая голову, принюхивалось; 5. Количество стоек на периферии поля; 6. Сумму двух указанных параметров (вертикальные стойки на периферии и центре поля) расценивали как показатель общей исследователькой деятельности животного; 7. Общую длительность «чесательного рефлекса» (груминга) регистрировали в секундах. 8. Подсчитывали количество эпизодов груминга за время пребывания крысы в установке; 9. Регистрировали время неподвижности крыс, когда они находились в состоянии пассивного бодрствования; 10-11. Вели учет количества мочеиспусканий - уринаций и болюсов (актов дефекаций), отражающих реакцию вегетативной системы на новизну обстановки.

Стандартный режим регистрации соблюдался нами в течение всех 10 дней тестирования. Эксперимент проводили в одно и то же время дня, в затемненной комнате с освещением центральной площадки поля, без постороннего шума и других раздражителей. После тестирования каждого животного ОП тщательно обрабатывали спиртовым раствором и промывали водой. Первичные данные (среднее значение за 10 дней) по всем параметрам теста для каждого животного заносили в программу Excel, где формировали таблицу данных по всей сумме экспериментов. Обработку и анализ данных проводили в программном пакете Statistica 5.5. С его помощью рассчитывали описательные статистики (выборочное среднее, стандартное отклонение и стандартную ошибку среднего). Сравнение показателей, полученных при регистрации поведения у двух групп изучаемых крыс, проводили в модуле Basik Statistics c определением значения критерия Стьюдента и уровня значимости. За достоверные принимали различия при уровне значимости p<0,05.

Результаты математико-статистического анализа для всех изученных параметров поведения, зарегистрированных в тесте ОП, представлены в таблице.

Таблица

Показатели поведения в тесте «открытое поле» (ОП) двух субпопуляций крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq1A DRD2

Параметры поведения

А1А1

А2А2

p

М±m

М±m

Амбуляции в центре ОП

7,82±0,53

3,05±0,32

<0,001

Амбуляции на периферии ОП

74,70±2,72

43,68±2,49

<0,001

Общая двигательная активность

82,70±3,09

46,73±2,75

<0,001

Количество вертикальных стоек в центре ОП

1,42±0,14

0,53±0,09

<0,001

Количество вертикальных стоек на периферии ОП

19,21±0,95

8,35±0,84

<0,001

Общее количество вертикальных стоек

20,63±1,04

8,88±0,88

<0,001

Общая длительность груминга (сек)

13,12±0,72

7,41±0,97

<0,001

Общее количество эпизодов груминга

2,97±0,17

2,04±0,27

<0,01

Неподвижность (сек)

1,12±0,26

9,80±3,17

<0,01

Уринации

0,09±0,02

0,03±0,01

<0,05

Боллюсы

0,11±0,04

0,15±0,06

<0,5

Они показывают, что по числу пересеченных квадратов в центре ОП у крыс групп А1А1 и А2А2 существуют значимые (р<0,001) различия. Средние значения, приведенные по данному параметру, оказались равны 7,82±0,53 у крыс группы А1А1 и 3,05±0,32 у группы А2А2, что указывает на меньшую в два раза посещаемость центра ОП животными второй группы по сравнению с первой. Среднее количество пройденных квадратов на периферии ОП также значимо различается (р<0,001), оно меньше у крыс группы А2А2. Сравнение результатов, полученных в данном исследовании, с ранее полученными на меньших по численности группах животных А1А1 и А2А2 [2], показывает, что они совпадают, подтверждая вывод о более выраженной двигательной активности крыс группы А1А1.

Меньшая двигательная активность крыс группы А2А2 легко объяснима длительным временем их пребывания в состоянии неподвижности. Численные характеристики, отражающие состояние неподвижности у этих крыс (9,80±3,17) практически в десять раз больше по сравнению с крысами А1А1 (1,12±0,26).

Сниженная в два раза двигательная активность крыс группы А2А2 позволяла предполагать, что эти крысы являются эмоционально неустойчивыми и им характерна высокая степень тревожности, по сравнению с группой А1А1. Однако, мы выявили общую закономерность для обеих групп изучаемых крыс - крысы группы А1А1, как и группы А2А2 больше двигались по периферии ОП, т.е. предпочитали посещать темные периферические квадраты. Это, вероятно, можно трактовать как проявление тревожности, характерной для обеих изучаемых групп животных, что ставит вопрос о необходимости исследования их поведения в установках, позволяющих получить более конкретные данные о тревожном состоянии крыс.

Как следует из данных таблицы, крысы А1А1 совершали большее количество стоек как в центре (p<0,001) так и на периферии ОП (р<0,001) по сравнению с крысами группы А2А2. Общее количество стоек у крыс группы А1А1 увеличено вдвое (p<0,001), что свидетельствует о значительно большей исследовательской деятельности этой группы крыс.

Нами также отмечено, что имеет место значительно увеличенная (р<0,001) длительность груминга у крыс А1А1 - 13,12±0,72, по сравнению с крысами А2А2 - 7,41±0,97, при меньшем уровне значимости (р<0,01) в количестве его эпизодов (А1А1 - 2,97±0,17, А2А2 - 2,04±0,27).

Показатели количества дефекаций и уринаций Холл [11] предложил оценивать в качестве основных при изучении эмоционального фона животных. Достоверно значимые различия (p<0,05) выявлены нами при сравнении количества уринаций. При этом среднее значение этого показателя у группы А1А1 равно 0,09±0,02, оно превышает таковое у группы А2А2 (0,03±0,01), что, вероятно, свидетельствует о повышенном тонусе симпатической нервной системы. Таким образом, полученные нами данные показывают, что крысы А1А1, демонстрирующие большую двигательную активность, имеют и большее количество уринаций. Выявлена особенность поведенческой реакции крыс этой группы, которая противоречит общепризнанному представлению о том, что существует обратная корреляция между выраженностью двигательной активности грызунов в ОП и вегетативными компонентами ориентировочно-исследовательского поведения в виде уринаций и дефекаций [11,6,7].

Методика изучения поведения грызунов в ОП является одной из самых популярных тестов в нейробиологии поведения [5, 13], и широко используется в нейрогенетике поведенческого фенотипирования разных линий, а также трансгенных и мутантных животных [3, 10].

В недавней работе Минасяном [3] была проанализирована исследовательская активность мышей в различных модификациях ОП, различающихся по цвету, размеру и геометрическаой форме. Хотя исследовательская активность существенно зависела от внешних факторов среды [3], результаты работы показывают, что исследовательская активность в ОП у грызунов не зависит от размера, формы и цвета незнакомой арены, и что животные поддерживают достаточно консервативное (с точки зрения пространственной организации) поведение при исследовании новизны [8, 9].

Итак, проведенный анализ позволил выявить значимые различия в поведении крыс изучаемых двух субпопуляций. Крысы А1А1 по сравнению с крысами А2А2 показывают большую двигательную активность, более выраженную исследовательскую деятельность, у них больше по длительности груминг, а также количество эпизодов груминга. У них также более выражены вегетативные компоненты ориентировочно-исследовательского поведения в виде большего числа уринаций. Полученные результаты указывают на необходимость дальнейших исследований по изучению фенотипических характеристик данных двух субпопуляций крыс.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Калимуллина Л.Б., Ахмадеев А.В., Бикбаев А.Ф.и др. // Медицинская генетика, 2005, №5, с.198.
  2. Леушкина Н.Ф., Калимуллина Л.Б. //Успехи современного естествознания, 2008, № 10, с.18.
  3. Минасян А. //Нейроэтология, 2007, т. 9, №1, с. 32.
  4. Мусина А.М., Калимуллина Л.Б., Кузнецова Г.Д. Сб. научных статей Всеросс. научно-практич. конф. «Актуальные вопросы физиологии, психофизиологии и психологии. Уфа, РИЦ БашИФК, 2009, с. 105.
  5. Augustsson Н., Meyerson B.//J. Physiol. Behav.,2004. V. 81, p. 685.
  6. Broadhurst P.L. // Brit. J. Psychol., 1957. V.48, p.1.
  7. Denenberg V.H.// Ann. N.Y. Acad. Sci., 1969. V. 159, N3.p. 852.
  8. Drai D., Kafkafi N., Benjamini У. et al.// Behav. Bгain Res. 2001. V. 125. p.133.
  9. Edut S., Eilam D.// ВМС Ecol. 2003. V. 3, p. 10.
  10. Gross C., Santarelli L., Вгunner D. et аl. // Biol. Psychiatry. 2000. V. 48. p.1157.
  11. Наll F.S., Huang S., Fong G.W. et al.// Physiol. Behav. 2000. V. 71,p. 525.
  12. Kuznetsova G., Petrova E., Coenen A. M. et al.// Physiol. Behav. 1996. V. 60.p. 1165.
  13. Tang Х., Orchard S.M., Sanford L.D.// Behav. Brain Res. 2002. V. 136. p. 555.
  14. Vаlеntinuzzi V.S., Buxton О.М., Chang А.М. et аl.// Physiol. Behav. 2000. V. 69. p. 269.
  15. van Luijtelaar, G. Coonen A. // Epilepsy Res. 1989. V. 1. P. 297.