Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,823

APPLICATION OF HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY FOR ANALYSIS 4-HYDROXYBENZOIC ACID ESTERS

Osipov A.S. 1 Popova O.A. 1 Suleymanov R.R. 1 Nezdoleva M.V. 1
1 Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation
Исследована возможность применения хроматографических колонок с фенильными и нитрильными сорбентами для разделения эфиров 4-гидроксибензойной кислоты (парабенов) при определении антимикробных консервантов в лекарственных препаратах. В качестве подвижных фаз применяли смеси ацетонитрила или метанола и воды. При замене воды на буферный раствор КН2РО4 эффективность хроматографических колонок увеличивается в 1,3 раза. На фенильных и нитрильных колонках н-гептилпарабен имеет значительно меньшее время удерживания, чем на колонках С18. Хроматография парабенов может быть удобным инструментом для изучения свойств хроматографических колонок с фенильными и нитрильными сорбентами. Разрешение между пиками парабенов в условиях жидкостной хроматографии гидрофильных взаимодействий существенно меньше, чем в условиях обращенно-фазовой хроматографии. В отличие от аминогрупп, нитрильные группы практически не обладают сродством к фенольным гидроксильным группам парабенов в условиях жидкостной хроматографии гидрофильных взаимодействий.
The possibility of the use of chromatographic columns with phenyl and nitrile sorbents for separation of 4-hydroxy-benzoic acid esters (parabens) was investigated. As the mobile phase used a mixture of acetonitrile or methanol and water. The use instead water of the buffer solution KH2PO4 increases the efficiency of the columns is 1,3 times. On the phenyl and nitrile columns n-heptilpaben has a significantly lower retention time than C18 columns. Chromatography of parabens can be a useful tool for studying the properties of chromatographic columns with phenyl and nitrile sorbents. Resolution between the peaks of parabens in a hydrophilic interaction liquid chromatography significantly less than in conditions of reversed-phase chromatography. In contrast to the amino groups, nitrile groups have practically no affinity to the phenolic hydroxyl groups of parabens in a hydrophilic interaction liquid chromatography.
high performance liquid chromatography
hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)
4-hydroxybenzoic esters (parabens)
sorbents
United States Pharmacopeia
European Pharmacopeia

Эфиры пара гидроксибензойной кислоты (название соединений по Европейской фармакопее), или парабены (название соединений по Фармакопее США), применяют главным образом при изготовлении суспензий и микстур, а также в парфюмерной промышленности в качестве антимикробных консервантов. В этой статье для краткости изложения материала использовали наименование Фармакопеи США. Кроме того, парабены могут вводиться в состав твердых желатиновых капсул для предотвращения разрушения желатина микроорганизмами. Наиболее часто применяют метилпарабен (нипагин) и пропилпарабен (нипазол), их обычно используют совместно в соотношении по массе 4:1. Кроме того, бутилпарабен применяют в качестве пластификатора при изготовлении лекарственных форм. Условия хроматографирования парабенов полностью гармонизированы в соответствующих фармакопейных статьях Европейской фармакопеи и Фармакопеи США. Следует, однако, отметить, что наряду с нейтральными (фенольными) формами парабенов в Фармакопее США описаны натриевые (растворимые) формы парабенов [6, 7]. В монографиях зарубежных фармакопей приведена методика хроматографирования парабенов на колонках С18 150×4,6 мм (5 мкм) при длине волны 272 нм. В качестве подвижной фазы применяют смесь 6,8 г/л КН2РО4 в воде – метанол (35:65). Скорость потока – 1,3 мл/мин. Данные условия хроматографирования применяют при анализе метил-, этил- и пропилпарабенов. При анализе бутилпарабена соотношение компонентов подвижной фазы – 50:50. Изменение состава подвижной фазы вызвано необходимостью определения примеси в консерванте – изобутилпарабена [5]. Н-гептилпарабен не описан в фармакопейных статьях, его применяют в качестве внутреннего стандарта при количественном определении такролимуса в мазях и некоторых других препаратов. В данном случае применение внутреннего стандарта компенсирует эффект неполной экстракции препаратов из гидрофобной мазевой основы. В этом исследовании, н-гептилпарабен использовали только как гидрофобное соединение при изучении свойств хроматографических колонок с фенильными и нитрильными сорбентами.

Цель работы – исследование возможности применения хроматографических колонок с нитрильными и фенильными сорбентами для определения антимикробных консервантов в лекарственных препаратах.

Материалы и методы исследования

Работа проводилась c использованием хроматографа Agilent, серия 1100 с диодно-матричным детектором («Agilent Technologies», США). Разделение парабенов осуществляли на следующих колонках: Zorbax XDB C18 150×4,6 мм (5 мкм), Zorbax SB Phenyl 150×4,6 мм (3,5 мкм), Zorbax XDB CN 150×4,6 мм (5 мкм), Zorbax NH2 150×4,6 мм (5 мкм) («Agilent Technologies», США), Spherisorb Phenyl 150×4,6 мм (5 мкм) («Waters», США) и Диасфер Фенил 150×4,6 мм (5 мкм) («БиоХимМак», Россия). В работе использовали стандартные образцы метил-, этил-, пропилпарабенов Европейской фармакопеи, стандартный образец бутилпарабена Фармакопеи США. Стандартный образец 4-гидроксибензойной кислоты н-гептиловый эфир (н–гептилпарабен) («Dr. Ehrenstorfer GmbH», Германия).

Результаты исследования и их обсуждение

Некоторые результаты хроматографирования парабенов приведены в табл. 1. Следует отметить, что отклик детектора при 260 нм в 1,64 раза больше, чем при детектировании парабенов при 272 нм, учитывая невысокое содержание парабенов в лекарственных препаратах и желатиновых капсулах, детектирование при 260 нм более предпочтительно. Эффективность колонок при применении подвижных фаз (метанол – 50 мМ КН2РО4 или ацетонитрил – 50 мМ КН2РО4) в среднем в 1,3 раз больше, чем при применении аналогичных по содержанию органики подвижных фаз без буферного компонента. Не было выявлено особых преимуществ в использовании в качестве органических компонентов подвижных фаз ацетонитрила либо метанола. Необходимо отметить только заметное увеличение времени удерживания бутилпарабена, и особенно н-гептилпарабена, при использовании подвижных фаз, содержащих метанол на хроматографических колонках с фенильными сорбентами. Хотя разрешение между пиками низших гомологов парабенов при этом возрастает, не наблюдается заметного увеличения их времен удерживания. Время удерживания н-гептилпарабена на колонках с фенильными и нитрильными сорбентами значительно меньше, чем на колонке Zorbax XDB C18 (табл. 1, рис. 1, 2).

osip1.tif

Рис. 1. Хроматограмма модельной смеси стандартных образцов парабенов. Условия анализа: колонка Spherisorb Phenyl 150×4,6 мм (5 мкм); подвижная фаза – ацетонитрил – 50 мМ КН2РО4 (рН 4,6) (40:60); скорость потока – 1,0 мл/мин; детектирование 260 нм. 1 – метилпарабен, 2 – этилпарабен, 3 – пропилпарабен, 4 – бутилпарабен, 5 – н-гептилпарабен

osip2.tif

Рис. 2. Хроматограмма модельной смеси стандартных образцов парабенов. Условия анализа: колонка Zorbax XDB CN 150×4,6 мм (5 мкм); подвижная фаза – ацетонитрил – вода (40:60); скорость потока – 1,0 мл/мин; детектирование 260 нм. 1 – метилпарабен, 2 – этилпарабен, 3 – пропилпарабен, 4 – бутилпарабен, 5 – н-гептилпарабен

osip3.tif

Рис. 3. Хроматограмма модельной смеси стандартных образцов парабенов. Условия анализа: колонка Zorbax NH2 150×4,6 мм (5 мкм); подвижная фаза – ацетонитрил – 2мМ КН2РО4 (98:2); скорость потока – 1,0 мл/мин; детектирование 260 нм: 1 – н-гептилпарабен, 2 – бутилпарабен, 3 – этилпарабен, 4 – метилпарабен

Времена удерживания и разрешение между пиками метил-, этил-, пропил- и бутилпарабена при различных условиях хроматографирования*

Колонка.

Состав подвижной фазы

Разрешение между пиками метил- и этилпарабена

Разрешение между пиками пропил- и бутилпарабена

Время удерживания метил-парабена, мин

Время удерживания пропил-парабена, мин

Время удерживания н-гептил-парабена, мин

Zorbax XDB C18

150×4,6 мм (5 мкм)

Ацетонитрил – 50 мМ КН2РО4 (4:6)

9,78

16,08

2,94

6,07

69,58

Zorbax XDB C18

150×4,6 мм (5 мкм)

метанол – 50 мМ КН2РО4 (55:45)

9,29

16,15

3,14

8,17

57,33

Zorbax XDB C18

150×4,6 мм (5 мкм)

Ацетонитрил – вода (4:6)

6,51

13,30

2,65

6,105

61,57

Zorbax SB Phenyl

150×4,6 мм (3,5 мкм)

Ацетонитрил – вода (4:6)

6,87

10,76

3,17

5,29

22,1

Spherisorb Phenyl

150×4,6 мм (5 мкм)

Ацетонитрил – вода (4:6)

3,01

3,89

2,67

4,24

7,51

Spherisorb Phenyl

150×4,6 мм (5 мкм)

Ацетонитрил – 50 мМ КН2РО4 (4:6)

3,51

4,60

2,73

6,35

7,60

Spherisorb Phenyl

150×4,6 мм (5 мкм)

метанол – 50 мМ КН2РО4 (4:6)

5,79

6,88

3,31

6,24

40,88

Zorbax XDB CN

150×4,6 мм (5 мкм)

Ацетонитрил – вода (4:6)

3,43

5,09

2,72

3,65

8,30

Диасфер Фенил

150×4,6 мм (5 мкм)

Ацетонитрил – 50 мМ КН2РО4 (4:6)

5,64

8,26

3,58

5,86

22,06

Zorbax NH2

150×4,6 мм (5 мкм)

Ацетонитрил –

2 мМ КН2РО4 (95:5)

1,04

5,31

4,94

4,48

Zorbax NH2

150×4,6 мм (5 мкм)

Ацетонитрил –

2 мМ КН2РО4 (98:2)

1,07

10,3

9,60

8,70

Примечание. *средняя величина пяти определений для каждого условия хроматографирования.

Данный факт объясняется тем, что при сорбции парабенов на этих сорбентах ключевую роль имеют p-p взаимодействия между бензольными кольцами анализируемых соединений и функциональными группами сорбентов. В отличие от этого, на сорбентах С18 главным образом имеют место гидрофобные взаимодействия между поверхностью сорбента и анализируемыми соединениями, поэтому время удерживания сильно зависит от длины алифатических цепей анализируемых соединений. Аналогичный эффект повышения селективности фенильных и нитрильных сорбентов к ароматическим группировкам и к системам сопряженных двойных связей наблюдался при анализе антиоксидантов бутилгидроксианизола и бутилгидрокситолуола [1, 4], а также сорбиновой кислоты [3]. По причине присутствия фенольных гидроксильных групп в молекулах анализируемых соединений, также можно ожидать схожести поведения парабенов и антиоксидантов на колонках с аминосорбентами в условиях жидкостной хроматографии гидрофильных взаимодействий [2]. На рис. 3 приведена хроматограмма разделения модельной смеси парабенов в данных условиях хроматографирования, при этом меняется очерёдность элюирования анализируемых соединений по сравнению с обращённо-фазовой хроматографией. Следует отметить, что разрешение между пиками парабенов в условиях жидкостной хроматографии гидрофильных взаимодействий существенно меньше, чем в условиях обращенно-фазовой хроматографии (таблица). Так, при использовании в качестве подвижных фаз смесей ацетонитрила и воды, время удерживания метилпарабена на колонке Zorbax XDB CN 150×4,6 мм (5 мкм) возрастало только с 1,64 мин до 1,73 мин при увеличении содержания ацетонитрила в подвижной фазе с 90 % до 99,9 %.

Заключение

Хроматографические колонки с фенильными и нитрильными сорбентами могут быть использованы для определения парабенов в лекарственных препаратах. Исследования по хроматографии в гомологическом ряду парабенов также могут быть полезным инструментом для изучения физико-химических свойств фенильных и нитрильных сорбентов. Разрешение между пиками парабенов в условиях жидкостной хроматографии гидрофильных взаимодействий существенно меньше, чем в условиях обращенно-фазовой хроматографии.