Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,823

DEPENDENCE OF HISTOMORPHOMETRIC FEATURES OF THE ARTICULAR CARTILAGE ON THE CONDITIONS OF THE EXPERIMENTAL TIBIAL LENGTHENING

Stupina T.A. 1
1 FSBI «Russian Ilizarov Scientific Center «Restorative Traumatology and Orthopaedics» of the RF Ministry of Health
Методами компьютерной морфо- и стереометрии в суставном хряще при удлинении голени у собак в режиме 1,0 мм в сутки за 4 и 8 приемов выявлены изменения деструктивно-репаративного характера. Сопоставительный анализ комплекса количественных параметров суставного хряща показал, что к концу дистракции при режиме «1 мм за 4 приема» более выражена деструктивно-пролиферативная реакция. Высокая интенсивность деструктивных процессов при режиме «1 мм за 4 приема», вероятно, связана с большей (0,25 мм), чем при режиме «1 мм за 8 приемов» величиной одномоментного удлинения (0,125 мм). Параллельно в хряще развиваются регенераторные процессы, наиболее выраженные в периодах фиксации и после снятия аппарата. Сравнивая течение восстановительного процесса, можно отметить, что при более дробной дистракции «1 мм за 8 приемов» восстановление структуры суставного хряща протекает наиболее интенсивно.
The methods of computer morpho- and stereometry detected both destructive and reparative changes in the articular cartilage of dogs that underwent lengthening with the rate of 1 mm a day made with 4 or 8 steps daily. Comparative analysis of the quantitative parameters of the articular cartilage showed that by lengthening of 1 mm for 4 steps, the destructive proliferative response was more expressed by the end of distraction. High intensity of destructive changes in this mode seems to be associated with a greater (0.25 mm) single step that in the mode of 1 mm for 8 steps (0,125 mm) single step. Regenerative processes in the cartilage went parallel but were more expressed in the fixation period and after the apparatus removal. It can be concluded that by higher frequency of daily distraction (1 mm/8 steps), the recovery of the articular cartilage structure ran more intensively.
articular cartilage
lengthening
morphometry

Из всех существующих на сегодняшний день методов ортопедического удлинения именно метод Г.А. Илизарова получил международное признание и широкое внедрение в практику, однако вплоть до настоящего времени при его применении остаётся нерешённой проблема функциональной реабилитации пациентов – в частности, восстановление объёма движений в суставах [1, 5].

С целью уменьшения травматизации тканей при дистракционном остеосинтезе академик Г.А. Илизаров предложил разделить суточное удлинение (1 мм) на несколько приёмов (разовых удлинений) – принцип дробной и высокодробной дистракции [4]. В условиях дозированной низкодробной дистракции с разовым удлинением 0,5 мм зарубежными исследователями [10, 12] были отмечены истончение, разволокнение суставного хряща, в части наблюдений выявлены некротические изменения. При применении автодистракторов, позволяющих распределить суточное удлинение на 120 приёмов, повреждения суставного хряща существенно уменьшаются [11]. Меньшая травматизация суставного хряща в условиях высокодробной дистракции установлена также при автоматическом удлинении с темпом 1 мм за 60 приёмов [9]. В настоящее время недостаточно изучено состояние суставного хряща при наиболее часто применяемом в клинике режиме ручной дистракции «1 мм за 4 приёма» с разовым удлинением 0,25 мм, отсутствуют исследования по сопоставлению этого режима с высокодробным режимом ручной дистракции «1 мм за 8 приемов» (величина разового удлинения 0,125 мм). Актуальность исследования структурной реорганизации суставного хряща при биомоделировании ортопедического удлинения конечностей и сопоставительного количественного анализа по единому алгоритму определяется недостаточными знаниями об адаптивности и пластичности хрящевой ткани в обозначенных условиях и необходимостью этих знаний для оптимизации методик реконструктивной ортопедии.

Цель исследования

Изучение зависимости количественных характеристик суставного хряща от условий удлинения смежного сегмента конечности с темпом 1 мм за 4 и 8 приёмов.

Материалы и методы исследования

Исследован суставной хрящ наружных мыщелков бедра 5 интактных (контроль) и 28 опытных собак, которым после закрытой флексионной остеоклазии в течение 28 суток удлиняли голень аппаратом Илизарова в 1-й серии (n = 16) с темпом 1 мм за 4 приема, во 2-й серии (n = 12) с темпом 1 мм за 8 приемов. Экспериментаторы д.м.н. С.А. Ерофеев и к.в.н. А.А. Еманов. Содержание, оперативные вмешательства и эвтаназию животных проводили в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения Российской Федерации к работе экспериментально-биологических клиник и принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986). Манипуляции, проводимые на животных, рассмотрены и одобрены этическим комитетом «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова». Гистоморфометрические и стереологические исследования проведены через 28 суток дистракции, 30 суток фиксации и 30 суток без аппарата по серийным полутонким срезам увеличенной (6–8 мм2) площади [7, 8], окрашенным метиленовым синим и основным фуксином. Цифровые изображения получали с помощью АПК «ДиаМорф» (Москва) на фотомикроскопе «Оpton» (Германия). В графическом редакторе «ВТ-Мастер-Морфология» («ВидеоТест», С-Пб) измеряли толщину (h, мкм) хряща, рассчитывали долю хондроцитов в составе изогенных групп (NNis.gr., %) от общего количества хондроцитов и долю пустых лакун (NNem.lac., %) от общего количества лакун. В поверхностной, промежуточной и глубокой зонах хряща регистрировали объемную (VVch, %) и численную (NAch, мкм-2) плотности клеток, площадь хондроцитов (Sch, мкм2). В этих же клетках определяли объемную плотность ядер (VVn) и цитоплазмы (VVc) в долях единицы, а также их отношение (VVn/ VVc ) – ядерно-цитоплазматический индекс (NCI). Для анализа цифрового материала использовали описательную статистику. В зависимости от характера распределения и объема выборки достоверность различий оценивали с помощью критериев Стьюдента или Вилкоксона в программе AtteStat, версия 1.0 в электронных таблицах Microsoft Excel 97. Для исследования в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) «JSM-840» (Jeol, Япония) образцы суставного хряща с подлежащей субхондральной костью дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации, пропитывали в камфене (3,3-диметил- 2-метиленбицикло[2,2,1]гептан – ГОСТ 15039-76) по оригинальной методике [6], высушивали на воздухе, напыляли серебром.

Результаты исследования и их обсуждение

К концу дистракции в обеих сериях при исследовании в СЭМ отмечено разволокнение суставной поверхности, вскрытые клеточные лакуны (рис. 1). Наиболее интенсивные деструктивные изменения (разволокнение коллагенового каркаса поверхностной зоны) отмечены в серии 1.

В обеих сериях при исследовании полутонких срезов хряща деструктивно измененные хондроциты были выявлены во всех зонах, но наибольшая частота встречаемости отмечена в поверхностной и глубокой.

Морфометрический анализ комплекса параметров позволил уточнить различия в состоянии суставного хряща при ручной дистракции с темпом 1 мм за 4 и 8 приемов. К концу периода дистракции в 1-й серии отмечено достоверное (р < 0,001) увеличение h хряща относительно контроля (таблица), что обусловлено более выраженной дезорганизацией межклеточного вещества поверхностной зоны, набуханием основного вещества и коллагеновых волокон. На последующих этапах эксперимента выявлено достоверное (р < 0,001) снижение анализируемого параметра относительно контроля и 2-й серии эксперимента. Во 2-й серии к концу периода дистракции h хряща достоверно (р < 0,001) ниже контроля. На последующих этапах эксперимента выявлена тенденция к увеличению, через месяц после снятия аппарата h хряща сопоставима с контролем.

В поверхностной зоне через 28 суток дистракции NAch в серии 1 достоверно (p < 0,05) снижена, относительно контроля и серии 2, к концу эксперимента достоверно превышала контроль и значения серии 2 (таблица).

В серии 2 к концу эксперимента сохранялись сниженные значения NAch. В срок 30 суток фиксации в серии 1 VVch незначительно увеличивалась относительно предыдущего срока, но к концу эксперимента сохранялись достоверно (p < 0,05) сниженные значения. В серии 2 значения VVch через месяц фиксации и месяц после снятия аппарата сопоставимы с контролем (таблица). Низкие значения объемной плотности хондроцитов в серии 1 на фоне высокой численной плотности обусловлены резким снижением Sch (таблица). На всех этапах эксперимента в поверхностной зоне хряща 2-й серии выявлено снижение (p < 0,05) NCI (0,54 ± 0,03 через 28 суток дистракции; 0,35 ± 0,03 через 30 суток фиксации; 0,64 ± 0,03 через 30 суток баз аппарата; 0,75 ± 0,03 в контроле). В серии 1 снижение (p < 0,05) NCI выражено в меньшей степени, чем в серии 2 (0,64 ± 0,02 через 28 суток дистракции; 0,61 ± 0,05 через 30 суток фиксации и через 30 суток баз аппарата). Снижение параметров VVch, Sch в серии 1 к концу эксперимента может являться отражением деструктивных изменений хондроцитов, апоптоза. Самым ранним морфологическим проявлением апоптоза является появление в ядре резко очерченных уплотненных масс хроматина с внутренней стороны ядерной оболочки [2]. Морфологические признаки апоптоза чаще наблюдали в суставном хряще серии 1, при исследовании в СЭМ отмечены явления сжатия клеток с сохранением контактов с межклеточным матриксом (рис. 2, А).

st1a.wmf st1b.wmf

А Б

Рис. 1. СЭМ, поверхность, обращенная в полость сустава. Конец периода дистракции. А – 1 серия, увеличение 850, Б – 2 серия, увеличение 500

Количественные характеристики суставного хряща мыщелка бедра на этапах эксперимента удлинения голени

Параметры

VVch ( %,М ± σ)

NAch

(мкм-2,M ± σ)

Sch

(мкм2,M ± σ)

h (мкм, M ± m)

NNem.lac. ( %)

NNis.gr. ( %)

Контроль

Контроль

I

6,12 ± 2,43

8,21 ± 2,19

45,34 ± 10,51

475,55 ± 1,31

13,6

14,5

II

8,75 ± 2,54

4,45 ± 1,34

119,91 ± 24,37

III

12,26 ± 3,21

5,73 ± 2,15

129,31 ± 28,14

1 мм за 4 приема (ручные подкрутки)

28 суток дистракции

I

3,42 ± 1,96*

5,42 ± 1,68*

44,23 ± 12,98

710,34 ± 7,16

*

29,97

*

24,7

*

II

3,9 ± 0,68*

4,94 ± 1,33

53,64 ± 10,38*

III

4,99 ± 1,18*

4,91 ± 1,56*

70,81 ± 19,45*

30 суток фиксации

I

4,12 ± 1,26*

11,5 ± 3,44*

29,53 ± 7,15*

421,15 ± 4,82

*

20,85

*

20,18

*

II

4,67 ± 1,04*

6,3 ± 1,44*

71,13 ± 18,36*

III

6,58 ± 1,43*

6,51 ± 1,15*

80,75 ± 14,13*

30 суток без аппарата

I

4,14 ± 0,97*

12,21 ± 2,62*

27,75 ± 4,32*

416,94 ± 4,37

*

21,12

*

15,4

*

II

6,01 ± 1,39*

7,13 ± 2,68*

66,61 ± 15,01*

III

6,91 ± 1,97*

3,84 ± 2,64*

103,25 ± 29,92*

1 мм за 8 приемов (ручные подкрутки)

28 суток

дистракции

I

3,73 ± 1,62*

7,75 ± 1,79*■

30,09 ± 6,65*■

369,91 ± 2,57

*■

20,4

*■

21,14

*■

II

6,41 ± 2,34*■

5,94 ± 1,56*■

68,71 ± 16,33*■

III

9,06 ± 3,85*■

6,01 ± 1,49*■

96,86 ± 30,14*■

30 суток фиксации

I

6,32 ± 2,43■

7,92 ± 2,39*■

52,73 ± 18,44*■

415,38 ± 2,13

*■

19,7

*

31,2

*■

II

9,22 ± 3,18*■

5,68 ± 1,84*■

102,34 ± 19,74*■

III

9,16 ± 3,27*■

6,36 ± 2,08*

90,94 ± 23,66*■

30 суток без аппарата

I

6,53 ± 2,12■

4,59 ± 1,19*■

71,02 ± 21,61*■

468,24 ± 0,53

15,8

*■

33,5

*■

II

8,71 ± 1,68■

4,53 ± 1,12■

121,71 ± 22,35■

III

8,50 ± 1,34*■

4,87 ± 1,28*■

116,11 ± 33,18*■

Примечания. I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща.

* – достоверные различия с контролем, ■ – достоверные различия между сериями (для параметров VVch, NAch, NNem.lac, NNis.gr и Sch – р < 0,05, для h – р < 0,001).

st2a.wmf st2b.wmf

А Б

Рис. 2. Хондроцит в лакуне. СЭМ. А – увеличение 5500. Серия 1. Б – увеличение 4300. Серия 2. Многочисленные отростки (О) контактируют со стенкой лакуны. Стенки лакуны построены из коллагеновых фибрилл (Кф)

В серии 2 увеличение размеров клеток, снижение NCI свидетельствовали о повышении синтетической активности хондроцитов поверхностной зоны, при исследовании в СЭМ отмечали хондроциты, которые занимали всю клеточную лакуну, поверхность таких клеток имела бугристый рельеф, многочисленные отростки контактировали со стенкой лакуны, фиксируя положение клетки (рис. 2, Б).

В промежуточной зоне в обеих сериях на всех сроках эксперимента численная плотность клеток превышала контрольные значения, максимальные значения были выявлены в серии 1 в сроки 30 суток фиксации и месяц после снятия аппарата (таблица). В обеих сериях к концу периода дистракции выявлено уменьшение VVch, в серии 1 значения минимальные (таблица). Снижение VVch обусловлено уменьшением Sch в обеих сериях, наиболее выраженным в 1 серии. Через месяц фиксации в обеих сериях отмечена тенденция к увеличению VVch, наиболее выраженная во 2-й серии. К концу эксперимента значения VVch в серии 2 достигали контроль, в серии 1 достоверно (p < 0,05) ниже контроля. При 4-кратной дистракции отмечено достоверное (p < 0,05) увеличение Vvn, в результате чего NCI на всех этапах эксперимента превышал (p < 0,05) контроль (0,74 ± 0,04 через 28 суток дистракции; 0,34 ± 0,03 через 30 суток фиксации; 0,32 ± 0,03 через 30 суток без аппарата; 0,27 ± 0,02 в контроле). При 8- кратной дистракции значения NCI к концу дистракции увеличивались (0,32 ± 0,01), через месяцев фиксации за счет увеличения в большей степени Vvс снижались до 0,24 ± 0,01, к концу эксперимента вновь увеличивались до 0,34 ± 0,02. Выявленная динамика количественных характеристик клеток и их ядер промежуточной зоны суставного хряща в серии 1 может являться отражением дедифференцировки клеток и восстановления их пролиферативных потенций. Известно, что дедифференцировка, как реактивно-приспособительное изменение клеток, сопровождается увеличением относительных объемов ядер [3]. Так, к концу периода дистракции доля изогенных групп и доля пустых лакун в общем объеме выборки в 1-й серии превышала контроль и значения серии 2 (таблица). Значения доли пустых лакун в общем объеме выборки в этой серии максимальны. При некрозе происходит разрушение мембранного скелета с выходом ее содержимого в окружающее пространство, в том числе и факторов роста, тем самым в биологическом феномене некроза уже заложен фактор будущей регенерации [2]. Чем, возможно, объясняются интенсивно выраженные процессы гибели и пролиферации в серии 1. К концу эксперимента в обеих сериях сохранялись повышенные значения NNis.gr, максимальные значения отмечены в серии 2.

В глубокой зоне во 2-й серии NAch превышала контроль (таблица), за счет увеличения количества клеток в колонках, формирования изогенных групп, вокруг которых территориальный матрикс отсутствовал. В 1-й серии значения данного параметра значимо снижены. При светооптическом исследовании полутонких срезов выявлено изменение цитоархитектоники глубокой зоны, отсутствовало колончатое расположение клеток, появлялись бесклеточные поля, часть хондроцитов в состоянии деструкции, выявлены пустые лакуны. Через месяц фиксации NAch в обеих сериях достоверно (p < 0,05) превышала контроль, к концу эксперимента выявлена тенденция к снижению данного параметра, минимальные значения зарегистрированы в серии 1. В обеих сериях VVch на всех этапах эксперимента снижена, минимальные значения отмечены в серии 1. Низкие значения VVch обусловлены резким снижением Sch, интенсивнее выраженным в серии 1 (таблица). Значения NCI в серии 1 на этапах дистракции (0,24 ± 0,02) и через 30 суток фиксации (0,26 ± 0,02) сопоставимы с контролем (0,25 ± 0,02), в срок 30 суток без аппарата (0,17 ± 0,01) за счет увеличения Vvс снижены (p < 0,05). В серии 2 на этапе дистракции и в конце эксперимента значения NCI увеличивались (0,32 ± 0,02 и 0,27 ± 0,02 соответственно), а в срок 30 суток фиксации (0,21 ± 0,01) незначительно снижались.

Степень травматизации суставного хряща характеризует увеличение NNem.lac., что выявлено в обеих сериях, максимальные значения данного параметра зарегистрированы в 1-й серии через 28 суток дистракции, различия между сериями достоверны (таблица). При этом размерные характеристики хондроцитов в серии 1 более снижены по сравнению с контролем и серией 2. На последующих этапах эксперимента в серии 2 интенсивнее выражены процессы пролиферации (высокие значения NNis.gr), а увеличение к концу эксперимента параметров h хряща, VVch, Sch, характеризовало повышение биосинтетической активности хондроцитов.

Заключение

Таким образом, степень выраженности изменений в суставном хряще зависела от характеристик дистракции. Так, при режиме «1 мм за 4 приема» высокая интенсивность деструктивных процессов, вероятно, связана с большей (0,25 мм), чем при режиме «1 мм за 8 приемов» величиной одномоментного удлинения (0,125 мм). Сопоставительный анализ комплекса количественных параметров суставного хряща показал, что к концу дистракции при режиме «1 мм за 4 приема» более выражена деструктивно-пролиферативная реакция суставного хряща, чем при режиме «1 мм за 8 приемов». Параллельно в хряще развиваются регенераторные процессы, наиболее выраженные в периодах фиксации и после снятия аппарата. Сравнивая течение восстановительного процесса, можно отметить, что при более дробной дистракции в режиме «1 мм за 8 приемов» восстановление структуры суставного хряща протекает наиболее интенсивно.