Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,775

THE ANTIMICROBIAL PROPERTIES OF DRY EXTRACTS FROM RAW MATERIALS OF SORTS OF SORT VERONICA L.

Nemereshina O.N. Gusev N.F. Filippova A.V. Sycheva M.V.
Article is devoted to the study of antimicrobial properties of natural биологиче-ski active compounds – flavonoids and фенолкарбоновых acids, derived by the method of vortex турбоэкстракции of raw material of plants of the genus Veronica L. (this. Scrophulariaceae Juss.) The Ural regions. On the basis of the research the authors make a conclusion about possibility of use of vegetable raw materials Veronica L. in medical practice.

Лекарственные препараты, получаемые из растений, занимают достойное место среди средств профилактики и лечения многих заболеваний. На сегодняшний день в Государственном реестре лекарственных средств МЗ РФ приведено около 300 видов растений, применяемых в научной медицине и используемых для приготовления лекарственных средств [5]. В целом же в фитотерапии - научной и народной медицине, гомеопатии и ветеринарии используется около двух тысяч видов растений [12]. При этом биоразнообразие лекарственных растений используется далеко не полностью, что связано с отсутствием данных о ресурсах, недостатком сведений о химическом составе растительного сырья и малой изученностью фармакологических свойств фитопрепаратов [7].

Повсеместное распространение многих лекарственных растений, дешевизна получаемых из них препаратов и высокая физиологическая активность комплекса биологически активных (действующих) веществ - все это не может не привлекать внимание исследователей. Поэтому, одной из актуальных проблем медицинской и биологической науки является поиск новых источников лекарственного растительного сырья, способных расширить сырьевую базу и обновить ассортимент лекарственных средств растительного происхождения.

Растения в процессе роста и развития вырабатывают и накапливают вещества первичного и вторичного синтеза. Вещества первичного синтеза - белки, углеводы и липиды, выполняют в клетках энергетическую, пластическую и ряд других функций, обеспечивая процессы жизнедеятельности. Вещества вторичного синтеза представляют собой химические соединения, обладающие фармакологической активностью и способные оказывать регулирующее влияние на процессы обмена в растительных и животных организмах [13, 16]. Компоненты вторичного синтеза - флавоноиды, иридоиды, азотсодержащие вещества, фитонциды, эфирные масла, таниды, гликозиды, сапонины, ферменты, кумарины, органические кислоты, горечи и многие другие соединения, накапливаемые растениями и обладающие фармакологической активностью и терапевтическим действием, принято называть биологически активными веществами (БАВ).

Исследуя флору Предуралья в период экспедиций (1970-1988 и 1999-2010 гг.), мы обратили внимание на растения рода вероника - Veronica L., семейства Норичниковых - Scrophulariaceae Juss., которые имеют обширный ареал в Евразии и часто входят в состав субдоминантов растительных сообществ [8, 9]. Значительное число видов указанного рода широко применяются в фитотерапии нашей страны и ряда стран Западной Европы и Центральной Азии [1, 3, 11, 12, 14, 15].

В народной медицине препараты из растений рода Veronica применяются в качестве противовоспалительных, отхаркивающих, седативных, кровоостанавливающих, антитоксических и ранозаживляющих средств [1, 6, 8, 11, 12, 14, 19]. Некоторые виды рода Veronica обладают противораковым действием [3]. Вероника лекарственная - V. officinalis включена в состав многих сборов, лечебных чаев и биологически активных пищевых добавок [6]. Виды Veronica L. широко используются для лечения кожных болезней в ветеринарной практике, а их препараты, при исследовании на животных, показали эффективность при заболеваниях сердечно-сосудистой системы [6].

Целью нашего исследования являлось установление антибактериальных свойств препаратов, полученных из сырья растений рода Veronica, произрастающих в лесостепной и степной зонах Предуралья.

Из многообразия видов Veronica нами были выбраны наиболее распространенные в регионе представители: V.officinalis L. - в. лекарственная, V. spicata L. - в. колосистая, V. incana L. - в. седая и V. spuria L. - в. ненастоящая.

Материалы и методы исследования

Растительное сырье для исследования (надземная часть - трава) было заготовлено в период цветения растений в различных биомах Предуралья (2007-2010 гг.) и высушивалось воздушно-теневым способом.

В. лекарственная, относящаяся к растениям-мезофитам и встречающаяся в хвойных лесах была собрана в сосновом бору группы ассоциаций Pineta herbosa Кунгурско-Красноуфимской лесостепи Среднего Предуралья (окр. д. Крылово, Красноуфимского района Свердловской области).

В. ненастоящая, являющаяся ксеромезофитом была собрана на остепненных лугах (Александровские сопки, Красноуфимского района Свердловской области).

Два оставшихся вида: в. колосистая и в. седая относятся к группе ксерофитов и ареал их произрастания охватывает степную зону Южного Предуралья. В. колосистая собрана на остепненных лугах в злаково-разнотравных ассоциациях (окрестности с. Каменноозерное Оренбургского р-на, Оренбургской области)., а в. седая - на степных участках (каменистая степь) в типчаково-разнотравной ассоциации (окресности с. Саракташ, Оренбургской области).

На первом этапе нами проводилось фитохимическое исследование растений на содержание основных групп действующих веществ, оказывающих влияние на биологические процессы в растительных и животных организмах. Исследованию подвергались надземные органы растений (трава), собранные в период цветения растений в 2007-2010 гг. Обнаружение, идентификация и количественное определение алкалоидов, флавоноидов, дубильных веществ, сапонинов, кумаринов и иридоидов проводили методами принятыми Всероссийским Институтом Лекарственных Растений (ВИЛР) и Институтом биохимии растений РАН [4, 13, 16].

Для выявления антимикробной активности комплекса биологически активных веществ в видах рода Veronica из сырья растений нами были изготовлены сухие экстракты полифенольных соединений. Сухие экстракты готовили с использованием метода турбоэкстракции [2], основанном на вихревом перемешивании (с количеством оборотов до четырех тысяч в минуту) сырья и экстрагента при одновременном измельчении сырья. В качестве экстрагента использовали воду, нагретую до температуры 40-42 °С и этанол различной концентрации (табл. 1). Вытяжку отстаивали при температуре +5 °С в течение трёх суток, затем фильтровали, сгущали и высушивали в сушильном шкафу при температуре 70 °С. Полученный экстракт - порошок бурого цвета, исследовали на наличие флавоноидов методом двумерной хроматографии на бумаге.

Испытание антибактериальной активности полученных препаратов проводили в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. В качестве тест-микроорганизмов были использованы штаммы, рекомендуемые для исследования препаратов [4, 10, 17]: культура золотистого стафилококка - Staphyloccus aureus, штам-209 и культура кишечной палочки - Escherichia coli, штамм М-17, полученные из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов (г. Москва).

Исследования проводилось нами на жидких питательных средах методом двукратных серийных разведений [10]. Для этого готовили двукратное разведение извлечений в мясопептонном бульоне. Разведение готовили непосредственно в пробирках, подлежащих засеву. В каждом ряду разведений для контроля имели равное количество пробирок с соответствующими разведениями этилового спирта и две пробирки со средой без извлечения, а при исследовании водных извлечений в качестве контроля брали две пробирки со средой без извлечения.

Культуры для экспериментов готовились следующим образом: суточные агаровые культуры переносили петлёй в пробирку с физиологическим раствором, где находилось исходное разведение в 500 млн микробных тел в 1 мл по оптимальному стандарту. Полученную взвесь разводили бульоном, вначале в 100, а затем еще в 10 раз, для того, чтобы получить взвесь микробов содержащую 500 000 микробных тел в 1 мл, которая являлась рабочим разведением культуры. Изготовленную культуру вносили по 1 мл как в пробирки с извлечением, так и в контрольные, не содержащие извлечений.

Бактериальная нагрузка составляла, таким образом, 250 000 микробных тел в 1 мл. Вслед за этим штативы с пробирками помещались в термостат при температуре +37 °С. Результаты опыта учитывались через 20-24 часа. Регистрировали наличие роста (помутнение) или задержку роста в среде за счет бактериостатического действия извлечений. За действующую дозу принимали ту наименьшую концентрацию извлечения, при которой наблюдается задержка роста бактериальных культур [10].

Результаты исследования и их обсуждение

Фитохимическое исследование видов Veronica показало, что в исследуемых растениях наиболее характерными соединениями являются флавоноиды, таниды, азотистые вещества основного характера и иридоиды.

Основными действующими веществами в сырье растений являются флавоноиды группы флавона [6, 8, 13], составляющие комплекс полифенольных соединений. Химическая структура производных флавона - флавоноидов включает два ароматических кольца, соединенных друг с другом трехуглеродным фрагментом (С636):

   

Структура флавоноидов варьирует за счет изменения числа и положения гидроксильных групп, наличия или отсутствия С = O - группы в кольце С, положением кольца В. Флавоноиды способны образовывать гликозиды, эфиры и другие производные, отличающиеся по своим химическим и фармакологическим свойствам.

При исследовании сырья указанных видов Veronica методом двумерной хроматографии на бумаге в растениях обнаружены флавоноиды (до 16 соединений) и фенолкарбоновые кислоты (до 9 веществ). При этом нами [6, 8, 15] выделены и идентифицированы основные флавоноиды вероник: лютеолин (5,7,3´,4´-тетраоксифлавон), апигенин (5,7,4´-триоксифлавон), апигенин-7-β-D-глюкуронид; цинарозид или лютеолин-7-0-β-D-глюкопиранозид (5, 3´, 4´-триоксифлавон-7-0- β-D-глюкопиранозид).

 

Лютеолин-7-глюкозид (5, 7, 3´, 4´-тетраоксифлавон)                          Апигенин (5, 7, 4´-триоксифлавон)

  

Цинарозид (лютеолин7-0-β-D-глюкопиранозид или 5, 3´,4´-триоксифлавон-7-0-β-D-глюкопиранозид)               Гликозид апигенина (апигенин-7-β-D-глюкуронид)

Определение суммы флавоноидов в сырье показало незначительное повышение их содержания в растениях, собранных в степной зоне Южного Предуралья. Наибольшее количество флавоноидов извлекается при использовании в качестве экстрагента 40 и 70%-го этанола. В экстрактах из травы V. officinalis обнаружено шесть основных веществ флавоновой природы, в V. incana - пять, а в V. spicata - семь соединений. Установлено, что основными соединениями в сухих экстрактах являются: лютеолин, апигенин и их гликозиды. Таким образом, исследование содержания суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в препаратах из травы видов Veronica позволяет утверждать, что оптимальным экстрагентом является 40% этанол (таблица).

Для многих флавоноидов установлено антиоксидантное, противомикробное, противовоспалительное, противораковое действие [1, 3, 12, 13, 14, 18, 19], что обусловило широкое применение флавоноидсодержащего растительного сырья для производства лечебных и профилактических средств. Идентифицированные нами в растениях рода Veronica флавоноиды обладают выраженным противовоспалительным и противовирусным действием [1, 15], антиоксидантной активностью и способствуют восстановлению функциональной активности иммунной сис- темы [18, 19].

Кроме флавоноидов в исследуемых растениях нами выявлены фенолкарбоновые кислоты, четыре из которых идентифицированы как кофейная, хлорогеновая, неохлорогеновая и феруловая кислоты [8, 18]. Но в сухих препаратах рода Veronica L. выявлены только три фенолкарбоновые кислоты, две из которых идентифицируются как хлорогеновая и кофейная:

Хлорогеновая кислота

Кофейная кислота

Оценка антимикробного действия препаратов - сухих экстрактов из видов рода Veronica L. и содержание в них флавоноидов

№ п/п

Виды Veronica L.

Используемый экстрагент

Вид микроба и активность

Содержание суммы флавоноидов (%)

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

1

Veronica
оfficinalis L.

Вода

1:80

н/д*

1,04

20% этанол

1:1000

н/д

2,49

30% этанол

1:4000

н/д

4,76

40% этанол

1:4000

н/д

5,62

70% этанол

1:200

н/д

3,13

90% этанол

1:100

н/д

2,68

2

V. spuria L.

Вода

1:80

н/д

1,02

20% этанол

1:4000

н/д

5,98

30% этанол

1:2000

н/д

3,53

40% этанол

1:8000

н/д

7,67

70% этанол

1:2000

н/д

3,66

90% этанол

1:4000

н/д

5,82

3

V. spicata L.

Вода

1:100

н/д

1,12

20% этанол

1:1000

н/д

2,61

30% этанол

1:1000

н/д

2,83

40% этанол

1:2000

н/д

3,92

70% этанол

1:1000

н/д

2,14

90% этанол

1:1000

н/д

2,36

4

V.incana L.

Вода

1:80

н/д

0,96

20% этанол

1:1000

н/д

2,67

30% этанол

1:1000

н/д

2,48

40% этанол

1:4000

н/д

5,87

70% этанол

1:2000

н/д

3,52

90% этанол

1:1000

н/д

2,56

Примечание. * - отсутствие активности (экстракты недеятельны).

Фенолкарбоновые кислоты широко распространены в растениях и обладают антибактериальным и противовоспалительным действием [3, 21, 27], выполняют функции антиоксидантов и оказывают противоопухолевое действие [18, 19].

Помимо флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в сухих экстрактах из травы видов Veronica обнаружены: иридоиды группы аукубина, азотсодержащие вещества (холин), дубильные вещества, незначительное количество сердечных гликозидов, кумаринов и сапонинов.

Все отмеченное позволило нам считать обоснованным применение видов Veronica в современной фитотерапии в связи, с чем нами было проведено исследование антимикробного действия сухих экстрактов, изготовленных на основе сырья указанных растений.

Результаты проведённых опытов показали, что сухие экстракты из из травы видов Veronica: V.spicata, V.officinalis, V.incana, V.spuria обладают антимикробной активностью только в отношении St. aureus, а в отношении E. coli - они недеятельны (таблица). Сухие экстракты из травы перспективных видов Veronica (V. incana, V. officinalis, V. spicata, V. spuria), полученные при использовании в качестве экстрагента 40%-го этилового спирта, содержат максимальное количество суммы флавоноидов (от 3,92 до 7,67%) и обладают наибольшей антимикробной активностью, но только в отношении грамположительных микроорганизмов (до 1:8000). Самое высокое содержание суммы флавоноидов и наибольшая активность отмечены для препаратов из травы V. spuria L. (1:8 000), полученых экстракцией 40%-м этанолом (таблица).

Экстракты, полученные с помощью дистиллированной воды, обладают слабой активностью в отношении грамположительных микроорганизмов (St. aurеus) и недеятельны в отношении E.coli (таблица).

Выводы

  1. Эффективность антимикробного дейст- вия сухих экстрактов из сырья видов Veronica L. зависит от наличия биологически активных веществ и их количественного содержания.
  2. Препараты, полученные из сырья (травы) видов Veronica L. методом турбоэкстракции, характеризуются высоким содержанием суммы флавоноидов и проявляют высокую антимикробную активность in vitro в отношении Staphylococcus aureus.
  3. Сухие экстракты из травы видов Veronica L. показали отсутствие антимикробной активности in vitro в отношении Escherichia coli.
  4. Высокая антимикробная активность сухих экстрактов из травы видов Veronica оfficinalis L., V. spuria L., V. spicata L. и V.incana L. в отношении грамположительных микроорганизмов представляет практический интерес для разработки на их основе антибактериальных и противовоспалительных лекарственных средств.

Список литературы

  1. Бандюкова В.А. Антибактериальная активность флавоноидов некоторых видов цветковых растений // Растительные ресурсы. - 1987. - Т. 23, Вып. 4. - С. 607-611.
  2. Бобылев Р.В. Получение жидкого экстракта методом противоточной вихревой экстракции // Биофармацевтические аспекты получения и назначения лекарств. - М.: Сб. науч.тр. 1-го Моск. мед. ин-та, 1971. - С. 48-49.
  3. Гольдберг Е.Д. Препараты растений в комплексной терапии злокачественных новообразований / Е.Д. Гольберг, Е.П. Зуева. - Томск: Изд-во Томск ун-та, 2000. - 129 с.
  4. Государственная Фармакопея СССР. - 11-е изд.- М.: Медицина,1990. - Вып. 2 -400 с.
  5. Государственный реестр лекарственных средств. Т. 1.- М.: Минздрав России. Фонд фарм. информации, 2001. - 1277 с.
  6. Гусев Н.Ф. Флавоноиды растений рода Veronica L. / Н.Ф. Гусев, Н.М. Гусева, С.В. Теслов // Химия природных соединений. - 1974. - Т. 4 - С. 521.
  7. Гусев Н.Ф. К вопросу о новых перспективных видах лекарственного растительного сырья в южных областях России / Н.Ф. Гусев, О.Н. Немерешина // Известия ОГАУ. - 2008 - № 3(19). - С. 258-261.
  8. Гусев Н.Ф. К исследованию флавоноидов Veronica incana L. Степного Предуралья. / Н.Ф. Гусев, Немерешина О.Н. // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2005. - № 12. - С. 96-99.
  9. Еленевский А.Г. Систематика и география вероник СССР и прилегающих стран. - М.: Наука, 1978. - 258 с.
  10. Кашкин П.Н. Руководство по медицинской микологии / П.Н. Кашкин, Н.Д. Шеклаков. - М.: Медицина, 1978. - 325 с.
  11. Кьосев П.А. Полный справочник лекарственных растений. - М.: Изд-во Эксмо, 2005. - 992 с.
  12. Махлаюк В.П. Лекарственные растения в народной медицине. - М.: Нива России, 1992. - 478 с.
  13. Муравьёва Д.А. Фармакогнозия: учебник / Д.А. Муравьёва, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. - М.: Медицина, 2002. - 4-е изд., перераб., доп. - 656 с.
  14. Насыров Х.М. Антибактериальные свойства некоторых растений семейства норичниковых / Х.М. Насыров, Н.Н. Ворошилова, Ю.А. Глухарёв // Дикорастущие и интродуцируемые полезные растения в Башкирии. - Уфа, 1971. - Вып. 3. - С. 112-116.
  15. Немерешина О.Н. О некоторых аспектах рационального использования лекарственных растений Предуралья / О.Н. Немерешина, Н.Ф. Гусев, В.Н. Зайцева // Известия ОГАУ. - 2009. - № 2(22). - С. 308-311.
  16. Решетникова М.Д. Химический анализ биологически активных веществ лекарственного растительного сырья и продуктов животного происхождения: учебное пособие / М.Д. Решетникова, В.Ф. Левинова, А.В. Хлебников и др.; под ред. проф. Г.И. Олешко. - Пермь: 2004. - 335 с.
  17. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общ. ред. Р.У. Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М., 2005. - 832 с.
  18. Arora A. Modulation of liposomal membrane by flavonoids and isiflavonoids / Arch.Biochem., Biopsis. - 2000. - vol. 373, №1. - P. 102-109.
  19. Rice-Evans C. Structure - antioxidant activity relation-skips of flavonoids and phenolic acids / C. Rice-Evans, N.J. Miller, G. Paganga // Free Radical. Biol.Med. - 1996. - vol. 20, №7. - P. 933-956.