Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,775

COMPARATIVE ANALYSIS OF SECONDARY STRUCTURE OF THE GLUCOAMYLASES FROM ASPERGILLUS AWAMORI AND SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Kozhokina O.M. Kovaleva T.A.
The method of infrared microscopy was used for comparison of secondary structure of glucoamylases from Aspergillus awamori and Saccharomyces cerevisiae. The data of types of secondary structure, quantitative relationship ordered and unordered sites.

Исследование свойств глюкоамилаз различного происхождения приобретает особую значимость в связи с применением их в различных отраслях промышленности в роли биокатализаторов. Поиск путей регулирования биокаталитической активности ферментов неразрывно связан с расшифровкой закономерностей и молекулярного механизма катализа реакции гидролиза субстрата. Для решения данной задачи, наряду с определением функциональных свойств энзимов, необходимо проведение их структурного анализа.

Ранее нами были проведены исследования по установлению аминокислотного состава и осуществлен сравнительный анализ первичных структур глюкоамилаз из Aspergillus awamori X100 и Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7 [2, 3]. Определение типов и относительного количества элементов вторичной структуры является следующим этапом изучения пространственной организации белковой молекулы. В настоящее время существует большое количество предсказательных методов, позволяющих априорно на основе анализа аминокислотных последовательностей прогнозировать итог процесса свертывания полипептидной цепи в глобулу [1, 6, 7]. Однако, анализ данных литературы показал, что с помощью имеющихся методов можно предсказывать правильную вторичную структуру лишь для двух третей всех остатков белка [1, 4, 6, 7]. Значительная погрешность расчетов и их сложность обусловливают целесообразность проведения прогнозирования в тех случаях, когда исследование данного уровня иерархии белковой молекулы нельзя осуществить иным, более корректным способом.

Регистрация спектров поглощения в инфракрасной области является одним из самых чувствительных методов изучения особенностей вторичной структуры белка.

С помощью метода инфракрасной спектроскопии (ИКС) нами было осуществлено сравнение вторичных структур глюкоамилаз из Aspergillus awamori X100 и Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7. Измерение величин светопропускания белковых образцов проводили на многофункциональном ИК-спектрофотометре SPECORD М-80 (Германия) в диапазоне 4000-400 см-1. Обработку серии спектров проводили с учетом параметров всех реально существующих полос поглощения и их анализа.

Точность полученных данных контролировали как по средним квадратичным отклонениям, так и непосредственно по разности между спектрами, которая выводилась на график вместе с экспериментальными и модельными спектрами и полученными индивидуальными пиками.

Анализ ИК-спектров показал наличие полос поглощения амид I (1630-1660 см-1) и амид II (1520-1550 см-1), отличающихся для изучаемых ферментов лишь интенсивностью. Полоса амид I, обусловленная растяжением связи в карбонильной группе, указывает на наличие в молекулах глюкоамилаз различного происхождения структур с водородными связями и на присутствие неупорядоченных участков. Полоса амид II свидетельствует об одинаковом положении во вторичной структуре ферментов α-спиралей и β-структур. Колебания, порождающие ее, связаны с растяжением пептидных и деформацией водородных связей. Наличие пиков поглощения при 2860 и 2780 см-1 соответствуют симметричным колебаниям метильных групп. На осуществление асимметричных колебаний карбоксильных групп указывает полоса поглощения при 2520 см-1, а ряд пиков в области 1720-1872 см-1 обусловлен колебаниями карбонильных групп в концевых ассоциированных СООН-группах. Кроме того, слабо проявляются полосы поглощения при 3373-3254 см-1 , связанные с растяжением NH-связей. Пик в области 1000 см-1 определяется наличием в структуре фенилаланина, гистидина и триптофана монозамещенного ароматического кольца.

Таблица 1. Параметры полос амид I и амид II для полипептидов и белков

Конформация

Амид I

Амид II

Частота, см-1

Коэффициент экстинкции, моль-1см-1

Частота, см-1

Коэффициент экстинкции, моль-1см-1

α-спирали

1644-1649

750

1548-1553

340

β-структура

1615-1623

1691-1699

980

180

1530-1535

1563

340

100

Неупорядоченная структура

1650-1654

320

1546-1553

210

Анализ результатов, представленных в табл. 2, показал, что соотношение упорядоченных структур и нерегулярных участков в молекулах глюкоамилаз из Aspergillus awamori X100 и Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7 статистически не отличаются друг от друга.

Таблица 2. Содержание элементов вторичной структуры в молекулах глюкоамилаз из Aspergillus awamori X100 и Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7

Конформация

Глюкоамилаза из Aspergillus awamori

Глюкоамилаза из Saccharomyces cerevisiae

ν, см-1

Т, %

 %

ν, см-1

Т, %

 %

α-спирали

1646

34

24,4

1646

56

24,1

β-структура

1620

32

18,3

1620

60

18,8

Неупорядоченные участки

1652

34

57,2

1652

59

57,1

Из данных литературы следует, что в глобулярных белках, трехмерные структуры которых определены методом рентгено-структурного анализа, обычно около 60 % остатков аминокислот участвуют в формировании вторичной структуры [1, 4-6]. Показано, что содержание α-спиралей в среднем составляет 35 %, β-структур - 15 %, реверсивных поворотов - 20-25 %. В связи с тем, что с помощью метода ИКС не удается определить количество изгибов полипептидной цепи, в таблице 2 представлены результаты расчета α-спиралей, β-слоев и нерегулярных участков. Так как α-спираль является наиболее часто встречающимся в белках типом вторичной структуры, можно сделать предположение о ее высокой конформационной стабильности. С этим хорошо согласуется информация о расположении α-спирали в центре разрешенной области на карте Рамачандрана, а также тот факт, что диполи ее водородных связей имеют линейное расположение, отвечающее минимуму энергии. Кроме того, радиус спирали благоприятствует дисперсионному притяжению между остатками, расположенными по разные стороны от оси спирали [6, 7].

Таким образом, на основании результатов наших исследований установлено, что в состав вторичной структуры молекул глюкоамилаз плесневого и дрожжевого происхождения входят все основные элементы: α-спирали, β-слои и неупорядоченные фрагменты. При этом β-структура анализируемых ферментов характеризуется наличием антипараллельных цепей. Выявлено, что заниженное по сравнению со среднестатистическим содержание α-спиралей компенсируется за счет увеличения количества β-слоев.

Список литературы

  1. Кантор Ч. Биофизическая химия. - М.: Мир, 1984. - Т. 1. - 336 с.
  2. Кожокина О.М., Ковалева Т.А. // Фундаментальные исследования. - 2009. - № 8. - С. 19.
  3. Кожокина О.М., Ковалева Т.А. // Успехи современного естествознания. - 2010. - № 4. - С. 19.
  4. Попов Е.М. Структурно-функциональная организация белков. - М.: Наука, 1992. - 358 с.
  5. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. - М.: Высш. шк., 1996. - 335 с.
  6. Шерман С.А. Конформационный анализ и установление пространственной структуры белковых молекул. - Минск: Наука и техника, 1989. - 240 с.
  7. Шульц Г. Принципы структурной организации белков. - М.: Мир, 1982. - 360 с.