Кульдурское месторождение термальных вод располагается во внутриконтинентальной части юга Дальнего Востока, в районе поселка Кульдур Еврейской автономной области. Кульдурские источники выходят в центральной части Пионерского гранитного массива и приурочены к зоне меридионального разлома на участке пересечения с оперяющим его нарушением северо-восточного направления. Вмещающими породами являются палеозойские граниты и гранодиориты. Воды Кульдурского термального поля щелочные фторидно-хлоридно-кремниево-гидрокарбонатные натриевые, слабоминерализованные. Температура воды достигает 73 °С. Содержание общего углерода органического имеет невысокие значения и колеблется в пределах 0,3–3,7 мг/дм3 [1].

Известно, что термальные источники являются естественной средой обитания различных микроорганизмов. Водное микробное сообщество и бактериальные маты, образующиеся в местах выхода термальных вод, являются уникальным объектом исследований, поскольку они вовлечены в большое разнообразие трансформаций элементов, многие из этих трансформаций являются ключевыми стадиями геохимических процессов, происходящих в гидротермальных экосистемах. Гетеротрофные бактерии являются важным компонентом термальных вод и микробных матов, поскольку осуществляют деструкцию органических веществ и могут обладать уникальными свойствами и являться потенциальными продуцентами термостабильных ферментов [2, 3]. Изучение термофильных гетеротрофных бактерий, их потенциальной ферментативной активности и физиолого-биохимических особенностей представляет большой практический интерес, так как бактерии и продуцируемые ими ферменты могут найти широкое применение в промышленности, в том числе пищевой, фармацевтической, текстильной и других областях. Ранее было показано, что термальные воды Кульдур населены различной микрофлорой, но в небольшой численности [4]. Однако отсутствуют данные о потенциальной внеклеточной ферментативной активности бактерий, выделенных из Кульдурских терм, и их физиолого-биохимических свойствах.

Цель исследования: исследовать химический состав вод месторождения Кульдур, выделить гетеротрофные бактерии и изучить их некоторые физиолого-биохимические свойства и потенциальную внеклеточную ферментативную активность.

Материалы и методы исследования

Пробы воды отбирали в стеклянные бутыли объемом 1000 мл в трех повторностях, соблюдая условия стерильности, из скважин 1-87, 2-87, 3-87, 3-51, 5-51 термальных вод месторождения Кульдур. Отбор проб осуществляли в августе 2015 г. Также проводили отбор микробных матов, формирующихся на выходах термальных источников. Всего было отобрано 2 типа микробных мата. Отобранные пробы хранили в холодильнике не более 12 ч, затем анализировали в лаборатории. Химический анализ термальных вод осуществляли в аккредитованной лаборатории Дальневосточного геологического института ДВО РАН г. Владивосток. Для выделения и культивирования бактерий использовали традиционные методы практической микробиологии [5]. Для выделения термофильных микроорганизмов использовали питательные среды с различными донорами и акцепторами электронов [6]. Гетеротрофные бактерии учитывали на питательной среде YK следующего состава (г/л): CaCO3 – 1; MgSO4* 7H2O – 1; пептон – 5; дрожжевой экстракт – 5; глюкоза – 0,2; K2HPO4 – 0,2 [7]. Выделение микроорганизмов из подземных вод производили методом мембранной фильтрации. Микроорганизмы выращивали в термостате при температурах 25 °С и 50ºС в течение 1–7 суток. Тип клеточной стенки бактерий определяли по методу Грама. Морфологию, размеры, подвижность, спорообразование выделенных чистых культур исследовали с использованием светового микроскопа AxioStar plus (Carl Zeiss, Германия) [8]. Способность штаммов к росту при различных температурах и значениях рН питательной среды исследовали при инкубировании в среде YK. Диапазон рН устанавливали с разными концентрациями бикарбоната и карбоната натрия (от 5,0 до 13,0). Для изучения способности бактерий утилизировать моно- и дисахариды, спирты использовали готовые среды Гисса «Биокомпас-С» (Углич, Россия). Тестирование выделенных изолятов на наличие внеклеточных ферментов каталазы, протеазы, амилазы, липазы, лецитиназы проводили согласно [8]. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате при температурах 25 °С и 50 °С в течение 2–3 суток. О наличии энзиматической активности судили по появлению зон гидролиза субстрата вокруг посева бактерий на соответствующих средах.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты исследования химического состава термальных вод показали, что среди катионов в изученных скважинах значительно преобладали натрий (89,0–94,3 мг/л) и кремний (43,3–52,3 мг/л), при этом почти отсутствовал магний (0,0–0,03 мг/л). Среди анионов доминировали хлор (31,5–34,9 мг/л), фтор (17,7–18,9 мг/л) и сульфат-ионы (15,9–18,5 мг/л). В микроэлементном составе изученных вод наиболее преобладали литий (351,8–369,7 мкг/л), мышьяк (79,2–113,1 мкг/л) и стронций (65,3–83,3 мкг/л) (табл. 1). Отличительной чертой термальных вод этих скважин является высокая температура (до 72 °С), низкая минерализация 0,30–0,36 г/л и щелочная реакция (рН = 9,4–9,7). Как растворенные, так и спонтанные газы исследуемых терм представлены в основном азотом (до 98 об. %), примеси других газов (CO2, H2S, O2), как правило, незначительны.

Из термальных вод и бактериальных матов месторождения Кульдур на различных селективных средах были выделены чистые культуры мезофильных и термофильных гетеротрофных бактерий. Всего было изолировано 35 чистых культур (12 штаммов из подземных вод, 23 штамма из микробных матов). Среди изолированных из подземных вод гетеротрофных микроорганизмов преобладали плоские, матовые и глянцевые, светло-бежевые колонии с неровным краем, а также пигментированные светло-желтые и оранжевые выпуклые блестящие колонии (рисунок, а–в). Морфологическое разнообразие выделенных из бактериальных матов колоний было выше, здесь отмечены в основном колонии лишенные пигмента: различных оттенков бежевые, плоские и выпуклые, а также прозрачные, выпуклые и молочного цвета колонии (рисунок, г–е). По количеству выделенных бактерий значительно преобладали в подземных водах всех изученных скважин и микробных матах крупные грамположительные неподвижные спорообразующие каталазоположительные палочки размером 2,21–5,45 мкм в длину. Подобные крупные грамположительные палочки были выявлены нами ранее в подземных рассолах и техногенных водах хвостохранилищ Приморского края [9, 10]. Остальные изоляты были представлены палочками различной длины, а также кокками, спирохетами и вибрионами.

Исследование некоторых морфо-биохимических особенностей чистых культур гетеротрофных бактерий показало, что штаммы в основном были грамотрицательными (60 %), преимущественно неподвижными (70 %), аспорогенными (70 %), каталазоположительными (80 %) и оксидазоотрицательными (90 %) палочками с различным отношением к кислороду (табл. 2). Выделенные гетеротрофные бактерии больше всего были способны ферментировать глюкозу (65 %), т.е. обладали ферментативным типом метаболизма. По типу питания большинство штаммов относились к хемоорганотрофам. Исследование физиологических характеристик штаммов показало, что в целом культуры обладали способностью к росту в широком диапазоне рН 5,0–13,0 и температуры (до 60 °С) (табл. 3). Выявленные особенности роста данных микроорганизмов могут свидетельствовать об их приспособленности к высоким температурам и щелочным условиям среды. Культуры бактерий использовали широкий спектр субстратов. Все штаммы обладали способностью к росту на среде с комплексными субстратами, внесенными в качестве единственных источников углерода и энергии – дрожжевом экстракте и пептоне.

Заключение

Изучен химический состав термальных вод из различных скважин месторождения Кульдур. Показано, что отличительной чертой этих вод является высокая температура, низкая минерализация и щелочные условия среды. Воды наиболее обогащены натрием, кремнием, хлором, фтором, литием, мышьяком и стронцием. Из термальных вод и микробных матов выделены 35 штаммов гетеротрофных бактерий, для которых изучены физиолого-биохимические свойства и потенциальная ферментативная активность. Отмечено, что среди выделенных штаммов в основном преобладали грамотрицательные, неподвижные, аспорогенные, каталазоположительные палочки различной длины. Культуры были способны к росту в широком диапазоне рН и температуры, утилизировали достаточно широкий спектр сахаров и спиртов бактерий и проявляли высокую амилолитическую, протеолитическую, липолитическую и более низкую лецитиназную внеклеточные ферментативные активности.

Полученные данные позволяют утверждать, что вода и бактериальные маты термальных источников Кульдур населены уникальным сообществом гетеротрофных термофильных микроорганизмов. Несомненно, что это бактериальное сообщество играет особую роль в функционировании гидротермальной экосистемы, в том числе и в биогеохимических преобразованиях, именно за счет своей высокой потенциальной метаболической активности.

Авторы выражают благодарность ген. директору санатория «Кульдур» С.Н. Гончарову и начальнику Кульдурской гидрогеологической станции санатория А.Л. Кравченко за предоставление возможности отбора проб и помощь при проведении исследований.