В настоящее время в терапии многих заболеваний активно применяются препараты на основе биологически активных веществ (БАВ) лекарственного происхождения. При этом актуальность применения БАВ в медицинской практике с каждым годом возрастает. Лекарственные средства растительного происхождения на основе корней лопуха находят широкое применение в онкологической практике [1]. Химический состав сока молодых побегов лопуха, который богат БАВ, не изучен и представляет научный интерес, требующий дополнительных исследований. Растения этого семейства (Compositae) обладают противоопухолевой активностью и представляют ресурс разнообразных полисахаридов, аминокислот, флавонидов и других веществ и могут служить перспективным сырьем для применения в различных отраслях медицинской промышленности. В связи с этим представляет интерес идентификация веществ, входящих в сок молодых побегов лопуха, и их сравнения с химическим веществом, выделенным ранее из водного экстракта корней лопуха [1].

Цель исследования: изучение и прогноз химических соединений сока молодых побегов лопуха и сравнительный анализ с веществом β-аспарагин, выделенного из корней лопуха, методом ИКФурье-спектроскопии.

Материалы и методы исследования

Объект исследования – молодые побеги лопуха Arctium Lappa L. (Lappa major Gaertn.) семейства сложноцветных. Исследуемый вид встречается в регионе Нижнего Поволжья среди кустарников по всей степной и лесостепной зоне. Сбор растений для анализа производился в мае в период активного формирования стеблей до начала цветения. Учитывая недостаточную изученность химических элементов, входящих в его состав, который богат биологически активными веществами, а также сложный и многокомпонентный состав органических соединений, входящих в сырье, исследование проводилось в расширенном диапазоне инфракрасного спектра от 400 до 4000 cм-1.

Для решения этой задачи в качестве инструментария исследования использовался Фурье ИК-спектрофотометр PerkinElmer, гидравлический пресс для таблетирования образцов. Количество исследуемого образца в таблетке KBr составляло ~ 0,0008 г. В целях повышения достоверности исследований при подготовке образцов к таблетированию применялась сублимационная сушка экстрактов в чашках Петри в течение 3 суток с предварительной заморозкой до 80 град. Цельсия на установке FDU – 2100.

Результаты исследования и их обсуждение

На рис. 1 представлены ИК-спектры образцов сока молодых побегов Arctium Lappa L. ИК-спектральный анализ показал, что исследуемые образцы 1 и 2 имеют полосы поглощения, которые характеризуют химический состав растения: углеводы, белки, жиры [2].

Сравнение ИК-спектров образцов, очищенных центрифугой и без нее, показывает на относительную идентичность полос поглощения на всех характерных частотах, что говорит о незначительном влиянии дисперсных фракций, выделенных из сока молодых побегов лопуха, на спектральную картину поглощения и не окажет существенного влияния на качество идентификации химических соединений, входящих в состав исследуемых образцов. Однако наблюдаются отличия в оптической плотности образцов, о чем говорит разница в интенсивности поглощения на частотах менее ~1468 см-1. В этом случае разница интенсивности поглощения образцов достигает максимальных значений 5–7 %. Отличия интенсивности поглощения в области больших частот (более ~1500 см-1) минимальны (составляют порядка 1–2 %) и относятся к области поглощения в которой проявляются валентные колебания ряда функциональных групп. В большую разницу в интенсивностях поглощения образцов на частотах менее ~1500 см-1 попадают области скелетно-деформационных колебаний ряда функциональных групп, которая, по всей вероятности, связана с вкладом дисперсных фракций таких органических веществ, как лигнинов.

Так, например, валентные колебания групп на OH и CH2 на частотах ~3400 и ~2925 см-1 соответственно, показывают на наличие углеводов в растительном сырье [2, 3]. Для белков характерна полоса в области частот близкой к 3300 cм-1, которая обусловлена колебанием группы NH и принимает участие в образовании водородной связи.

Картина дополняется полосами Амид І и Амид ІІ в области частот 1600–1500 cм-1, которая связана с природой аминокислот. У большинства полипептидов и белков имеются полосы амид І и амид ІІ которые поглощаются в области 1650 и 1550 cм-1, но могут встречаться и отличия, которые могут вносить изменения в спектр с учетом образования водородных связей.

Таким исключением могут быть циклические пептиды, которые поглощаются на частотах близких к ~1610 и ~1513 cм-1 А для полосы амид ІІ на частотах ~ 1527 и 1550 cм-1 [3]. Область 1500–1700 см-1 cодержит ряд интенсивных полос, отнесенных к Амид I, Амид II, Амид III. О наличии пептидов говорят поглощения в полосах, характерных для Амид I и Амид II, которые подтверждаются валентными колебаниями связи С=О (Амид I) и плоскостными деформационными колебаниями связи NH (Амид II) [2].

Исследуя положение этих полос в спектре, можно получить сведения о молекулярной форме, с определенной степенью достоверности осуществить идентификацию молекулярного соединения, но необходимо учитывать что в твердой форме вещества на поглощение могут влиять и другие факторы (например, температура). Поэтому идентификация полосы Амид ІІ у белков и пептидов носит затруднительный характер по причине наличия в этой области спектра полосы поглощения колебаниями ионизированной карбоксильной группы.

Кроме того надо учитывать, что у многих белков полоса амид ІІ частично перекрывается полосой поглощения ионизированной карбоксильной группы. Поэтому идентификация частот поглощения в этой группе весьма проблематична. По этим полосам поглощения можно судить о наличии белков, которым соответствуют полосы поглощения на частотах близких к ~1600 см-1 (1596, 1599) (Амид I); ~1700 см-1 (1700,1696) (Амид II); ~1400 см-1 (1396, 1395) (Амид III) (таблица) [2; 9].

На частотах близких к ≈1150 см-1 проявляются валентные колебания P=Ost фосфорной кислоты, входящей в состав фосфолипидов, также деформационно-плоскостные колебания амидной группы NHδip NH2C=O (1117 и 1115 см-1) [3]. О присутствии небелковых молекул в виде фосфолипидов говорят поглощения на частотах, которые характерны для фосфорной кислоты в виде валентных колебаний на частотах P=Ost (1110–1050 см-1) и P-Ost (879–835 см-1) [3] на наличие липидной группы жирных кислот в образцах указывает поглощение группы СНn –) в полосе 3010–2853 см-1 на частоте 2932 см-1 [2].

Полосы поглощения в группах (N-H)st и (СНn–)st, которые характерны амидам и липидам, близки и совпадают [3]. Поглощения на частотах 616, 615 cм-1 относятся к группе NH2C=O [3] и свойственны амидо-карбонильным соединениям, в виде дополнительных поглощений с деформационно-плоскостными колебаниями NHδip в молекуле вещества. В ИК-спектре (рис. 2, 3) присутствуют полосы поглощения, которые подтверждают наличие следующих функциональных групп, которые характерны для вещества β-аспарагин.

Валентные колебания связи N-H в первичных аминах проявляются на частотах 3343, 3323 cм-1. Валентные колебания амидной группы NH наблюдаются на частотах 2932 и 2920 cм-1, а ее деформационные колебаниях на частотах 1700 и 1696 cм-1 (полоса Амид II). Что характерно для первичных амидов, вторая область проявления этих колебаний находится в полосе меньших частот 1396 и 1385 cм-1 (таблица, спектры 1 и 2). Валентные колебания карбонильной группы (С=О) амидов обнаружены на частотах 1596, 1599 cм-1 {полоса Амид I(C=O)st}. Концентрацию карбонильных групп на этих частотах с учетом коэффициента экстинкции можно определить по методу, изложенному в монографии, которая в образцах 1 и 2 составила 1,16∙10-3 и 1,08∙10-3 моль/см соответственно [4, 5].

Такой подход позволит прогнозировать концентрацию вещества в образцах полученных как из корней лопуха, так и из его молодых побегов. Таким образом, область частот 1500–1700 cм-1 содержит ряд интенсивных полос, которые можно отнести к полосам Амид I, II, III. Уширенная полоса на максимальных частотах поглощения 616, 615 cм-1 соответствует деформационным колебаниям связи N – H в аминах.

Рис. 3. Химическое соединение β-аспарагин [1]

Сравнение полос поглощения в спектрах образцов 1 и 2 (рис. 1) со спектром вещества β-аспарагина выделенного из корней лопуха позволяет сделать предположение, что это химическое соединение с высокой достоверностью содержится в соке молодых побегов лопуха. Отличия в виде сдвигов максимумов поглощения на 40–50 cм-1 в сторону меньших частот поглощения, а в области деформационных колебаний аминогруппыNH на 185 cм, а также появление дополнительного поглощения в области деформационных колебаний на частоте ≈ 527 cм-1, могут быть связаны с наложением крутильных, плоскостных и скелетно-деформационных колебаний молекулы вещества [6]. Что может указывать на изменение химического состава вещества.

Скелетные колебания в области низких частот поглощения проявляются у вторичных амидов на частотах около ~ 600 cм-1. Для белков и вторичных амидов характерной является размытая полоса поглощения в виде внеплоскостных деформационных колебаний группы NH с максимумом около ~ 700 cм-1.

Выводы

С помощью метода ИК Фурье-спектроскопии впервые изучен состав сока молодых побегов лопуха, произрастающего в регионе Нижнего Поволжья, и удалось осуществить прогнозирование органических веществ, входящих в его состав. Анализ результатов показал, что химический состав вещества с высокой степенью достоверности по своему химическому составу совпадает с веществом β-аспарагин. Наблюдаемые отличия в полученных спектрах можно рассматривать как изменение химического состава вещества. Прогнозирование количества вещества в образцах на этапе исследования может проводиться по содержанию концентраций групп Амид I(C=O)st с учетом коэффициента экстинкции [5] на частоте максимального поглощения этой группы. Для уточнения возможных химических изменений целесообразно провести выделение вещества из водного экстракта молодых побегов лопуха и его дополнительного изучения методами физико-химического анализа, включая метод ЯМР. Появление новых полос, отличающихся и дополняющих спектральную картину вещества на частотах 1117, 1115 cм-1 и 879, 857 cм-1, можно отнести к валентным колебаниям P=Ost группы фосфорной кислоты в фосфолипидах R(RO)PO2– в интервалах 1110–1050 см-1 и 875–855 см-1. Поглощения на частотах 768, 711 cм-1 и 512, 510 cм-1 свойственны δγСН2 деформационно-скелетным и скелетным колебания групп ~γ(NH2).