Введение. Одной из актуальных проблем современной медицины и фармации является создание новых лекарственных средств, обладающих комплексным действием. К числу таких препаратов относятся органические кислоты, которые обладают антистрессовым действием. Одной из таких органических кислот является кислота янтарная. Она участвует в ряде биохимических реакций энергетического, структурного и ферментного обеспечения организма. Ее широкий фармакологический спектр действия предполагает исследования по созданию новых лекарственных форм. Входящие в состав всех животных и растительных клеток организма с аэробным типом дыхания, сукцинаты способны предотвращать или устранять постгипоксические нарушения энергетического метаболизма в организме и метаболический ацидоз. При этом целесообразно использовать ее в сочетании с природными биологически – активными веществами подобного действия, в частности с экстрактом прополиса, богатым фенольными соединениями. Целью настоящего исследования явилась разработка технологии ректальной и липосомальной лекарственных форм с кислотой янтарной и экстрактом прополиса и их влияния на процессы перекисного окисления липидов.

Материалы и методы

В процессе исследований для разработки оптимального состава и технологии суппозиториев с янтарной кислотой и экстрактом прополиса было использовано 12 различных композиций, из которых наиболее полное высвобождение кислоты янтарной происходило из четырех следующих составов, приведенных в таблице 1.Для выбора оптимального состава нами были изучены следующие показатели: высвобождение кислоты янтарной, время полного растворения или температура плавления, количественное определение. Результаты представлены в таблице 2 [2].Установлено, что наиболее оптимальными свойствами обладал образец № 4. Для улучшения биофармацевтических свойств нами были приготовлены подобные образцы с различным соотношением компонентов и добавлением дополнительных вспомогательных веществ. Изменение соотношений ПЭГ приводит к ухудшению процесса высвобождения, увеличению времени полного растворения. Добавление твина 80 способствует лучшему высвобождению, а при количественном определении методом спектрофотометрии растворы получаются прозрачными, не требующими фильтрования. На основании проведенных исследований определили оптимальный состав суппозиториев:

ПЭГ 400 – 0,5; ПЭГ 1500 – 0,5; ПЭГ 4000 – 0,5; Кремофор 1,0; Твин 80 – 0,1; Вода очищенная 0,5 мл; Кислота янтарная 0,1; Экстракт прополиса – 0,4 мл [3].

Для получения липосомальной суспензии (из расчета на 10 лекарственных форм) 5 г яичного лецитина растворяли в диэтиловом эфире при постоянном перемешивании на шейкере в течение 10 минут, эфир выпаривали на роторном испарителе под вакуумом на водяной бане при 37°С до образования липидной пленки, которую затем сушили в течение 2 ч. Полученную фосфолипидную пленку гидратировали 10 мл раствора, содержащего 1 г кислоты янтарной. Полученный раствор взбалтывали в течение 1 часа на шейкере, затем добавляли 2 мл экстракта прополиса и продолжали перемешивание в течение 2 часов. Для получения малых однослойных липосом использовали экструзионный метод, продавливая дисперсии липосом через мембранные фильтры «Nuclepore» (Whatman, Великобритания) с диаметром пор 400 нм по 20 раз с применением ручного мини-экструдера (Avanti Mini-Extruder, США).

Для определения степени включения кислоты янтарной к 10 мл липосомальной формы (точная навеска) прибавляли 10 мл раствора натрия хлорида 2 М, нагревали на водяной бане в течение 10 мнут, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут до полного осаждения липосом. Надосадочную жидкость помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 10 мл 0,1 моль/л раствора натрия гидроксида, растворяли невключившуюся кислоту янтарную Объем раствора доводили до метки 0,1 моль/л раствором натрия гидроксида, хорошо перемешивали. Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ – 56 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Параллельно проводили такое же определение с раствором РСО кислоты янтарной. Было установлено, что полученные липосомы характеризуются степенью включения кислоты янтарной 58,5%. Для увеличения этого показателя нами была предпринята попытка введения криопротектора. Было установлено, что максимальное включение (69,7%) наблюдается при использовании 0,2% раствора сахарозы. Для повышения стабильности и достижения максимального включения кислоты янтарной нами предложено использовать сочетание фосфолипида с холестерином. Введение холестерина повышает прочность липосомальной мембраны за счет ограничения подвижности жирнокислотных цепей фосфолипида. Установлено, что при соотношении 1:0,2 наблюдается максимальный эффект включения кислоты янтарной (около 80%).

Определение антиоксидантной активности проводили в опытах in vivo. Эксперимент проводили на беспородных лабораторных крысах обоего пола массой 190 – 280 г в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей [5].

Содержание продуктов перекисного окисления липидов определяли спектрофотометрически по методике И.А. Волчегорского с соавторами [1].

Сущность метода заключается в измерении светопоглощения диеновых коньюгатов, образующихся при переокислении и перегруппировке двойных полиненасыщенных жирных кислот. Наличие максимумов светопоглощения в области 230 – 238 нм позволяет судить о содержании гидроперекисей в липидном экстракте. Максимум светопоглощения в области 260 – 290 нм свидетельствует об окислительной деструкции липидных гидроперекисей.

Определение проводили по методике. В пробирку из химически устойчивого пластика вносили 0,5 мл гомогената ткани в изотоническом растворе, содержащем 0,1% ЭДТА или равный объем ЭДТА- стабилизированной плазмы крови (конечная концентрация ЭДТА в плазме 1 мг/мл). Добавляли 5 мл смеси гептан-изопропанол в объемном соотношении 1:1. Пробирку закрывали пластиковой пробкой, встряхивали и помешали в лабораторный шейкер на 20 минут. Полученный экстракт центрифугировали, переносили в высокие стеклянные пробирки и разбавляли 5 мл смеси гептан-изопропанол (3:7). В разбавленную липидную вытяжку вносили 2 мл раствора хлороводородной кислоты (рН = 2) и оставляли на 30 минут для полного разделения экстракта на фазы. Верхнюю (гептановую) фазу осторожно декантировали ипереносили в отдельную пробирку, избегая частичного смешивания фаз. Водноспиртовую часть липидной вытяжки освобождали от воды и растворенных в ней примесей. Для этого в освобожденный от гептановой фазы экстракт добавляли не менее 1 грамма сухого натрия хлорида. Пробирку встряхивали и оставляли на 30 минут для отстаивания водной фазы. Изопропанольную фазу декантировали, избегая ее контаминации водной фазой. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре СФ – 56 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при трех длинах волн: 220,232 и 278 нм.

Определение содержания конечных продуктов перекисного окисления липидов проводили по вышеуказанной методике, используя в качестве аналитической длины волны 400 нм. Для оценки интенсивности аскорбат-индуцированного ПОЛ к изопропанольным экстрактам добавляли индуцирующую ПОЛ смесь (0,5 мМ аскорбиновой кислоты и 50 мкг сульфата железа). Через 10 минут, когда наблюдается наибольшее изменение содержания молекулярных продуктов липопероксидации, проводили их спектрофотометрическое определение.

Активность каталазы определяли по методу Королюка М.А. Для этого к к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода вносили 0,1 мл изучаемого образца. В холостую пробу вместо сыворотки вносили 0,1 мл воды очищенной и инкубировали при 370С в течение 10 минут, после чего реакцию останавливали добавлением 1 мл 4% раствора аммония молибдата. Интенсивность окраски измеряли на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которой вместо перекиси водорода вносили 2 мл воды очищенной [4].

Результаты и обсуждение

Введение исследуемых веществ проводили в течение 7 дней ректально или перорально в концентрации 100 мг/кг. Параллельно проводили такое же определение с кислотой янтарной. Расчет индексов окисления, отражающих относительный уровень первичных и вторичных продуктов ПОЛ, соответственно, проводили по отношению оптических плотностей Е232/Е220 и Е278/Е220. Относительное содержание шиффовых оснований рассчитывали по отношению поглощения при 400 нм к оптической плотности при 220 нм.

Окисляемость липидных экстрактов оценивали по соотношению величин оптических плотностей Е232/Е220, Е278/Е220, определяемых до и после внесения инициирующей ПОЛ смеси и выражали в процентах по отношению к исходному уровню

Содержание каталазы рассчитывали по формуле:

Е = (Ахол-Аоп)×V×t×K (мкат/л),

где Е – активность каталазы в мкат/л; А – оптическая плотность холостой и опытной проб; V – объем вносимой пробы, 0,1 мл; t – время инкубации, 600 сек; К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный 2,22*103 мМ-1*см-1.

Результаты представлены в табл. 3.