При изучении общебиологических закономерностей репаративного хондрогенеза многие авторы в качестве экспериментальной модели используют коленный сустав собаки [3, 6]. Доказано, что зоны гиалинового хряща коленного сустава собаки по расположению и строению аналогичны гиалиновому хрящу человека [3], что важно при экстраполяции экспериментальных данных в клинику. Для определения степени отклонения гистоморфометрических характеристик суставного хряща от нормы возникает необходимость сравнения с аналогичными параметрами суставного хряща интактных животных. Кроме того, необходимы дополнительные знания об особенностях суставного хряща собак при инволютивных изменениях. Так, несмотря на значительные успехи в распознавании патогенеза дегенеративно-дистрофических процессов в суставе, нет единого мнения о пусковых механизмах и степени структурных перестроек его компонентов при инволютивных изменениях [8, 9].

Цель – изучить гистоморфометрические и метаболические характеристики суставного хряща мыщелков бедра собак при инволютивных изменениях.

Материалы и методы исследования

Объект исследования – суставной хрящ мыщелков бедра 11 собак в возрасте 2-х, 5-ти и 8-ми лет. Содержание и эвтаназию животных проводили в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения Российской Федерации к работе экспериментально-биологических клиник и принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986). Для светооптического исследования применяли парафиновые срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, по Массону, для гистоморфометрии – серийные полутонкие срезы увеличенной (4 – 8 мм2) площади [5], окрашенные метиленовым синим и/или метиленовым синим-основным фуксином. Изображения микропрепаратов оцифровывали на АПК «ДиаМорф» (Москва) и анализировали в программе «ВидеоТест-Мастер-Морфология». Измерения проводили в микрометрах после предварительной геометрической калибровки по оцифрованной с тем же увеличением шкале объект-микрометра. Измеряли толщину (h, мкм), рассчитывали объемную плотность хондроцитов (VVch, %) в ткани, численную плотность хондроцитов (NАch), долю (%) пустых лакун (NNem.lac.) и изогенных групп (NNis.gr.) в общем объёме выборки. При цито- и кариометрии в поверхностной, промежуточной и глубокой зонах хряща определяли площадь хондроцитов (Sch, мкм2) и их ядер (Sn, мкм2), объемную плотность ядер (VVn, в долях единицы) и цитоплазмы (VVc, в долях единицы), рассчитывали ядерно-цитоплазматический индекс (NCI). Для анализа данных использовали описательную статистику. В зависимости от объема выборки и характера распределения достоверность различий оценивали с помощью критериев Стьюдента или Вилкоксона в программе AtteStat, версия 1.0 [1] в электронных таблицах Microsoft Excel 2007. Различия считали значимыми при р<0,05.

С помощью рентгеновского электронно-зондового микроанализатора «INСA Energy 200» (Oxford Instrumets Analytical, Англия), смонтированного на сканирующем электронном микроскопе «JSM-840» (Jeol, Япония) в суставном хряще определяли концентрацию серы (ωS, вес.%) и кальция (ωСа, вес.%).

Результаты исследования и их обсуждение

В 2 года в суставном хряще четко определялось зональное строение, базофильная линия непрерывная на всем протяжении. Все зоны хряща имели обычное строение, их гистоморфометрическая характеристика приведена нами в работе [4].

При исследовании суставного хрящ животных 5 лет выявлено его истончение, разволокнение, нарушена гомогенность межклеточного вещества, отмечена демаскировка коллагеновых волокон (рис.1А). В промежуточной зоне основная часть хондроцитов находилась в состоянии деструкции (рис.1Б). В глубокой зоне отсутствовало колончатое расположение клеток. В части наблюдений выявлено нарушение целостности базофильной линии, проникновение сосудов в хрящ (рис. 1В). При окраске метиленовым синим метахромазия имела очаговый характер. По данным Pilin A. et al. (2007), изменение в окраске тканей может быть маркером определенного возраста и развивающихся дистрофических изменений [10].

Рис. 1. Суставной хрящ собаки в возрасте 5 лет. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х. А – поверхностная зона, нарушена гомогенность межклеточного вещества, демаскировка коллагеновых волокон (ДКВ). Б – промежуточная, В – глубокая зона

В суставном хряще собак в возрасте 8-ми лет, как и в предыдущем возрастном периоде, сохранялись очаги разволокнения. На границе поверхностной и промежуточной зон наблюдалось достаточно высокое содержание хондроцитов, характеризующихся как биосинтетически активные. Такие клетки имели светлые гомогенные ядра и базофильную цитоплазму (рис. 2А). В более глубоких слоях промежуточной и в глубокой зоне отмечены дезинтегрированные хондроциты, а также накопившиеся липиды (рис.2Б). Наблюдалось нарушение четкости контуров базофильной линии, ее фрагментация. В зоне кальцифицированного хряща выявлены активированные остеокласты, отмечены участки, в которых кальцифицированный хрящ истончен, либо замещался костью (рис. 2В).

Рис. 2. Суставной хрящ собаки в возрасте 8 лет. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х. А – граница поверхностной и промежуточной зон, Б – хондроциты глубокой зоны, В – граница кальцифицированнго хряща (КХр) и субхондральной кости (СК)

При гистоморфометрическом анализе суставного хряща выявлено снижение его толщины с возрастом. По сравнению с предыдущим возрастом в 5 лет отмечено снижение объемной и численной плотности хондроцитов. В 8 лет объемная и численная плотность хондроцитов вновь увеличивалась (табл. 1).

Таблица 1

Количественные характеристики суставного хряща собак в разные возрастные периоды

Примечание. Жирным шрифтом выделены достоверные различия с предыдущим возрастным периодом.

Анализ количественных характеристик на клеточном уровне в поверхностной зоне выявил по сравнению с 2 летним возрастом увеличение площади клеток в 5 лет с последующим снижением к 8 годам, относительно предыдущего возрастного периода. В 5 и 8 лет отмечено снижение ядерно-цитоплазматического индекса, в связи с более значительным ростом объемной плотности цитоплазмы (табл. 2). В промежуточной зоне в 5 лет отмечено снижение площади клеток и увеличение объемной плотности ядер и ядерно-цитоплазматического индекса (табл. 2). Присутствие таких клеток может являться отражением деструктивных изменений, апоптоза, либо дедифференцировки клеток и восстановления их пролиферативных потенций.

Таблица 2

Количественные характеристики хондроцитов суставного хряща собак в разные возрастные периоды (M±σ)

Примечание. Жирным шрифтом выделены достоверные различия с предыдущим возрастным периодом.

Известно, что дедифференцировка, как реактивно-приспособительное изменение клеток, сопровождается увеличением относительных объемов ядер [2]. В этом возрасте отмечено повышение численной плотности пустых лакун и изогенных групп по сравнению с предыдущим возрастным периодом (табл. 1). В 8 лет, относительно возраста 2 лет сохранялись сниженные значения площади хондроцитов и объемной плотности их ядер и ядерно-цитоплазматического индекса (табл. 2). В глубокой зоне выявлено увеличение площади хондроцитов и уменьшение объемной плотности их ядер и ядерно-цитоплазматического индекса с возрастом животного (табл. 2).

Методом электронно-зондового микроанализа обнаружено неравномерное распределение серы по зонам суставного хряща во всех возрастных периодах: наибольшее содержание серы было выявлено в глубокой зоне, наименьшее – в поверхностной. В 5 лет концентрация серы снижалась относительно предыдущего возрастного периода, что свидетельствовало о снижении в матриксе хряща сульфатированных гликозаминогликанов, в 8 лет ωS вновь увеличивалась (табл. 3).

По литературным данным, у людей при старении в хрящевой ткани снижается гидратация фибрилл матрикса, одновременно увеличивается содержание сГАГ и изменяется их состав [7].

Таблица 3

Изменение содержание серы (вес.%) в суставном хряще с возрастом

Примечание. Жирным шрифтом выделены достоверные различия с предыдущим возрастным периодом.

С возрастом отмечено накопление кальция в некальцифицированном и кальцифицированном хряще. Максимальные значения концентрации кальция зарегистрированы в 8 лет (табл. 4).

Таблица 4

Изменение содержание кальция (вес.%) в суставном хряще с возрастом

Примечание. Жирным шрифтом выделены достоверные различия с предыдущим возрастным периодом.

Заключение. При исследовании суставного хряща мыщелков бедра собак в возрасте 2-х лет четко определялось зональное строение, суставная поверхность не разволокнена, целостность базофильной линии не нарушена. Морфологическая организация суставного хряща мыщелков бедра собак в возрасте 5-ти и 8-ми лет свидетельствовала о наличии деструктивно-дегенеративных процессов выраженных во всех зонах хряща, но интенсивнее в глубокой зоне. К инволютивным изменениям можно отнести нарушение гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, изменение окраски межклеточного вещества (снижение интенсивности, очаговое окрашивание), отсутствие колончатого расположения клеток в глубокой зоне, нарушения базофильной линии и проникновение сосудов в хрящ. Выраженные признаки инволютивных преобразований, выявленные в 5 лет постнатальной жизни собак, включали минимальные показатели содержания серы, численной и объёмной плотности хондроцитов, значительно увеличены доля пустых лакун, доля изогенных групп, содержание кальция. В возрасте 8 лет по сравнению с другими возрастными периодами площадь хондроцитов промежуточной и глубокой зон достигала максимума, по сравнению с двухлетним возрастом на 13,5% было увеличено содержание серы, но и содержание кальция увеличивалось. Возможно, в период от 5 до 8 лет в хряще развиваются компенсаторно-приспособительные изменения, препятствующие дальнейшему старению, зарегистрировано повышение значений доли изогенных групп в общем объеме выборки. Полученные гистоморфометрические характеристики суставного хряща могут быть использованы при дифференциальной диагностике возрастных инволютивных изменений, при изучении деструктивно-репаративных изменений при моделировании и лечении суставной патологии в эксперименте.