В 1974 году Тиссиерес и соавт. [2] впервые обнаружили, что в ответ на повышение температуры среды происходит активация синтеза специфической группы белков. Эта группа белков получила название белки теплового шока – шапероны (heat shock proteins, Hsp). Позже было установлено, что синтез этих белков индуцируется не только при повышении температуры, но и при многих других неблагоприятных стрессорных на организм воздействиях, а также под влиянием некоторых гормонов и ростовых факторов. В связи с этим белки теплового шока стали называть стресс-белками [6]. Было установлено, что в ответ на тепловой шок в клетках эукариот включается активация транскрипции всех генов, индуцируемых стрессом, осуществляемая специальным транскрипционным фактором (фактор теплового шока HSF). В клетках, не подвергшихся стрессу, HSF присутствует и в цитоплазме и в ядре в виде мономерной формы, связанной с шапероном Hsp70, и не имеет ДНК-связывающей активности.
В ответ на тепловой шок или другой стресс, Hsp70 отсоединяется от HSF и начинает укладывать денатурированные белки. HSF собирается в тримеры, у него появляется ДНК связывающая активность, он аккумулируется в ядре и связывается с промотором. При этом транскрипция шаперонов в клетке возрастает во много раз. После того, как стресс прошел, освободившийся Hsp70 опять присоединяется к HSF, который при этом теряет ДНК-связывающую активность и все возвращается в нормальное состояние. Аналогичным образом все происходит и при других стрессах. Согласно современной классификации, в основу которой положены различия в молекулярных массах, выделяют пять основных классов шаперонов (Hsp): Hsp100, 90, 70, 60 и малые Hsp (small Hsp, sHsp). Каждый из этих классов белков теплового шока выполняет характерные функции. Белки семейства Hsp60 могут участвовать в фолдинге сложно устроенных много доменных белков (таких как актин или тубулин), а также в АТР-зависимом исправлении ошибок в структуре частично денатурированных белков [8]. Hsp90 образуют сложный комплекс с шаперонами. Такой комплекс взаимодействует с рецепторами стероидных гормонов, обеспечивает эффективное связывание гормона с рецепторами и последующий перенос гормон-рецепторного комплекса в ядро. Помимо этого, белки класса Hsp90 участвуют в направленном переносе нескольких типов протеинкиназ к участкам их функционирования [5].
К последней группе белков теплового шока относятся Hsp с малыми молекулярными массами (sHsp – small heat shock proteins) – малые белки теплового шока, выполняющие множество разных функций в клетке. По данным ряда авторов окислительный стресс сопровождается усиленным синтезом sHsp [9]. В настоящее время большая часть исследователей склоняется к заключению, что sHsp защищают клетку от окислительного шока, хотя в литературе высказывается и противоположная точка зрения. Установлено, что N-концевой домен sHsp состоит аминокислотных остатков богатый метионином. Для всех sHsp хлоропластов этот участок очень консервативен и, по всей видимости, участвует в распознавании субстратов [10]. Предполагают, что sHsp каким-то образом активируют или стабилизируют глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу – фермент, продуктом которого является NADPH [7]. NADPH используется глутатионредуктазой для поддержания нормального уровня восстановленной формы глутатиона, используемого глутатионпероксидазой для разрушения гидроперекисей. Все эти данные указывают на то, что функциональные эффекты шаперонов связаны с тиоловыми системами, через которые обеспечивается их антиоксидантное и другое действие.
Ранее нами была высказана гипотеза посттрансляционной трансформации нормальных клеточных прионов РrРC в аномальные РrРSс прионы [3]. Причиной появления РrРSс является не копирование конформации с ранее поврежденного приона, а связано с нарушением функции шаперонов контролирующих фолдинг полипетидных цепей нормальных прионов и сохранение их нативной структуры. В частности, аномальные РrРSс за счет гидрофобного взаимодействия с гидрофобными радикалами активного центра тиоредоксинредуктазы и глутатионредуктазы, ингибируют эффекты этих ферментов, необходимых для восстановления тиоредоксина и глутатиона. Эти тиоловые соединения необходимы для как для антиоксидантной защиты, так и для правильной укладки полипептидной цепи белковых молекул, а их недостаток блокирует функцию шаперонов, контролирующих формирование вторичной и третичной структуры нормальных клеточных прионов.
С учетом вышеуказанных позиций, о функциональной связи белков теплового шока с активностью тиоловых систем, нами была поставлена задача, в сравнительном плане изучить состояние глутатиновой редокс-системы и глутатионпероксидазы при перегревании и при охлаждении организма животных, как экспериментальной модели стресса, при которой возможна индукция синтеза стрессорных белков – шаперонов.
Материалы и методы исследования
Исследования проведены на беспородных белых крысах в возрасте 3-3.5 месяца массой тела 160-200 г. Перегревание вызывали путем содержания животных в тепловой вентилируемой камере при температуре +40оС на протяжении 3-х часов. Охлаждение животных осуществляли путем содержания животных в холодовой камере при температуре +5оС на протяжения 3-х часов. О состоянии глутатионой редокс-системы судили по количеству общего, окисленного (GSSG) и восстановленного глутатиона (GSH) которые определяли по Вудворду и Фрею в модификации М.С. Чулковой, описанной С.В. Травиной [4]. Активность НАДФН2–зависимой глутатионредуктазы (ГР) определяли по методу С.Н.Власовой и соавтор [1]. Результаты исследования проанализированы при помощи t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В табл. 1, 2, 3 представлены данные об изменениях активности глутатион редуктазы и глутатионовой редокс-системы в крови, в печени и в головном мозге при перегревании и охлаждении. Во всех тканях и при перегревании, и при охлаждении обнаружено снижение активности глутатионредуктазы. Однако состояние глутатионовой редокс-системы при перегревании и при охлаждении имеет отличие. При перегревании в крови, в печени и в головном мозге уровень общего глутатиона, окисленного и восстановленного глутатиона снижается. При охлаждении в крови уровень общего, окисленного и восстановленного глутатиона повышается (табл. 1).
Таблица 1
Глутатионредуктаза и глутатионовая редокс-система в крови при перегревании и охлаждении (X±m)
|
Показатель |
Контроль n=12 |
Перегревание n=12 |
Охлаждение n=12 |
|
Глутатионредуктаза (ГР) мкмоль НАДФН2 \г Нв в мин |
5.8±0.34 |
3.6±0.22* |
3.8±0.26 |
|
Общий глутатион (мкмоль/л) |
1654.17±51.75 |
732.40±21.68* |
1914.89±46.39* |
|
Окисленный глутатион (GSSG) (мкмоль/л) |
106.62±5.06 |
24.88±1.40* |
146.52±13.96* |
|
Восстановленный глутатион (GSH) (мкмоль/л) |
1547.55±46.69 |
707.52±20.28* |
1768.37±32.43* |
|
Соотношение GSH /GSSG |
14.5±0.09 |
28.88±0.18* |
12.07±0.12* |
|
Примечание. * – р<0.05 в сравнении с контролем. |
|||
В печени и в мозге при охлаждении повышается уровень общего и восстановленного глутатиона, снижается уровень окисленного (табл. 2, 3). Что бы это всё значило? Для ответа на этот вопрос, основываясь на биологической функции тиолдисульфидной глутатионовой редокс – системе и её логической связи с ферментом глутатионредуктазой, мы в сравнительном плане решили рассчитывать соотношение уровней восстановленного (GSH) и окисленного глутатиона (GSSG). Величина этих соотношения (GSH /GSSG) представлена в таблицах 1,2,3.
В крови (табл. 1) при перегревании соотношение GSH /GSSG в сравнении с нормой увеличивается (с 14.5 до 28.88). Это значит, что в крови при перегревании преобладает процесс накопления восстановленной формы глутатиона, при соответствующем снижении уровня окисленного глутатиона и активности глутатионредуктазы.
При охлаждении в крови на фоне снижения активности глутатионпероксидазы и увеличения количества общего глутатиона, количества окисленного и восстановленного глутатиона, соотношение GSH /GSSG в сравнении с нормой снижается с 14.5 до 12.07 (табл. 1). Это говорит о том, что при охлаждении в крови животных преобладают процессы окисления глутатиона над его восстановлением в глутатионовой редокс-системе.
В печени (табл. 2) при перегревании на фоне сниженной активности глутатионпероксидазы и снижения всех форм глутатиона, снижается соотношение GSH/GSSG, что свидетельствует о преобладании процессов окисления над восстановлением. При охлаждении в печени на фоне сниженной активности глутатионпероксидазы и окисленной формы глутатиона, соотношение GSH /GSSG увеличивается. Это говорит о том, что в печени при охлаждении организма преобладает процесс восстановления глутатиона над его окислением.
Таблица 2
Глутатионредуктаза и глутатионовая редокс-система в печени при перегревании и охлаждении (X±m)
|
Показатель |
Контроль n=12 |
Перегревание n=12 |
Охлаждение n=12 |
|
Глутатионредуктаза (ГР) мкмоль НАДФН2 \г Нв в мин |
221.2±12.84 |
98.2±7.64* |
186.2±9.88* |
|
Общий глутатион (мкмоль/г) |
8.99±0.25 |
6.32±0.28* |
11.61±0.29* |
|
Окисленный глутатион (GSSG) (мкмоль/г) |
0.43±0.02 |
0.36±0.02* |
0.37±0.02* |
|
Восстановленный глутатион (GSH) (мкмоль/г) |
8.56±0.23 |
5.96±0.26* |
11.24±0.27* |
|
Соотношение GSH /GSSG |
19.90±0.10 |
16.55±0.05* |
30.37±0.12* |
|
Примечание. * – различия статистически значимы в сравнении с контролем р<0.05. |
|||
В головном мозге и при перегревании и при охлаждении организма активность глутатионпероксидазы снижается (табл. 3). Но при этом в мозге при перегревании снижается уровень всех форм глутатиона (общего, окисленного и восстановленного). При охлаждении незначительно снижается количество только окисленного глутатион и увеличивается количество и общего, и восстановленного глутатиона (табл. 3).
Таблица 3
Глутатионредуктаза и глутатионовая редокс–система в головном мозге при перегревании и охлаждении (X±m)
|
Показатель |
Контроль n=12 |
Перегревание n=12 |
Охлаждение n=12 |
|
Глутатионредуктаза (ГР) мкмоль НАДФН2 \г Нв в мин |
107.2±6.52 |
56.3±4.67* |
58.8±5.50* |
|
Общий глутатион (мкмоль/г) |
5.20±0.10 |
3.42±0.11* |
6.30±0.10* |
|
Окисленный глутатион (GSSG) (мкмоль/г) |
0.38±0.02 |
0.23±0.02* |
0.27±0.06* |
|
Восстановленный глутатион (GSH) (мкмоль/г) |
4.82±0.08 |
3.19±0.09* |
6.03±0.08* |
|
Соотношение GSH /GSSG |
12.68±0.09 |
13.86±0.11* |
22.33±0.21 |
|
Примечание. * различия статистически значимы в сравнении с контролем р<0.05. |
|||
Эти данные, а также увеличение соотношения GSH /GSSG и при охлаждении и при перегревании свидетельствует об усилении процессов восстановления глутатиона над его окислением в глутатионовой редокс-системе в головном мозге животных.
Заключение и выводы
Проведенными исследованиями обнаружено, что при перегревании и при охлаждении организма животных, как экспериментальной модели стресса, имеет место практически однотипное изменение функционального состояния одного из компонентов системы стресс-белков – глутатионредуктазы. Во всех тканях и при перегревании, и при охлаждении активность глутатионредуктазы снижается.
На фоне снижения активности глутатионредуктазы, изменения соотношения окисленной и восстановленной форм глутатиона (GSH /GSSG) глутатионовой редокс-системы специфично как относительно вида стресс фактора, так и относительно ткани:
В крови при перегревании баланс в глутатионовой редок-системе смещается в сторону восстановленных форм, при охлаждении в сторону окисленных форм.
В печени при перегревании баланс в глутатионовой редок-системе смещается в сторону окисленных форм, при охлаждении в сторону восстановленных форм.
В головном мозге при перегревании, и в большей степени при охлаждении организма баланс в глутатионовой редок-системе смещается в сторону восстановленных форм.
Таким образом, анализ полученных результатов подтверждает представление о том, что стрессорная реакция организма сопровождается изменениями функционального состояния компонентов белков теплового шока и связанных с их функцией глутатиновой редокс-системы, необходимой не только для антиоксидантной защиты, но и для фолдинга белковых молекул.