Введение. Одной из актуальных проблем современной медицины и фармации является создание новых лекарственных средств, обладающих комплексным действием. К числу таких препаратов относятся органические кислоты, которые обладают антистрессовым действием. Одной из таких органических кислот является кислота янтарная. Она участвует в ряде биохимических реакций энергетического, структурного и ферментного обеспечения организма. Ее широкий фармакологический спектр действия предполагает исследования по созданию новых лекарственных форм. Входящие в состав всех животных и растительных клеток организма с аэробным типом дыхания, сукцинаты способны предотвращать или устранять постгипоксические нарушения энергетического метаболизма в организме и метаболический ацидоз. При этом целесообразно использовать ее в сочетании с природными биологически – активными веществами подобного действия, в частности с экстрактом прополиса, богатым фенольными соединениями. Целью настоящего исследования явилась разработка технологии ректальной и липосомальной лекарственных форм с кислотой янтарной и экстрактом прополиса и их влияния на процессы перекисного окисления липидов.
Материалы и методы
В процессе исследований для разработки оптимального состава и технологии суппозиториев с янтарной кислотой и экстрактом прополиса было использовано 12 различных композиций, из которых наиболее полное высвобождение кислоты янтарной происходило из четырех следующих составов, приведенных в таблице 1.Для выбора оптимального состава нами были изучены следующие показатели: высвобождение кислоты янтарной, время полного растворения или температура плавления, количественное определение. Результаты представлены в таблице 2 [2].Установлено, что наиболее оптимальными свойствами обладал образец № 4. Для улучшения биофармацевтических свойств нами были приготовлены подобные образцы с различным соотношением компонентов и добавлением дополнительных вспомогательных веществ. Изменение соотношений ПЭГ приводит к ухудшению процесса высвобождения, увеличению времени полного растворения. Добавление твина 80 способствует лучшему высвобождению, а при количественном определении методом спектрофотометрии растворы получаются прозрачными, не требующими фильтрования. На основании проведенных исследований определили оптимальный состав суппозиториев:
ПЭГ 400 – 0,5; ПЭГ 1500 – 0,5; ПЭГ 4000 – 0,5; Кремофор 1,0; Твин 80 – 0,1; Вода очищенная 0,5 мл; Кислота янтарная 0,1; Экстракт прополиса – 0,4 мл [3].
Для получения липосомальной суспензии (из расчета на 10 лекарственных форм) 5 г яичного лецитина растворяли в диэтиловом эфире при постоянном перемешивании на шейкере в течение 10 минут, эфир выпаривали на роторном испарителе под вакуумом на водяной бане при 37°С до образования липидной пленки, которую затем сушили в течение 2 ч. Полученную фосфолипидную пленку гидратировали 10 мл раствора, содержащего 1 г кислоты янтарной. Полученный раствор взбалтывали в течение 1 часа на шейкере, затем добавляли 2 мл экстракта прополиса и продолжали перемешивание в течение 2 часов. Для получения малых однослойных липосом использовали экструзионный метод, продавливая дисперсии липосом через мембранные фильтры «Nuclepore» (Whatman, Великобритания) с диаметром пор 400 нм по 20 раз с применением ручного мини-экструдера (Avanti Mini-Extruder, США).
Для определения степени включения кислоты янтарной к 10 мл липосомальной формы (точная навеска) прибавляли 10 мл раствора натрия хлорида 2 М, нагревали на водяной бане в течение 10 мнут, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут до полного осаждения липосом. Надосадочную жидкость помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 10 мл 0,1 моль/л раствора натрия гидроксида, растворяли невключившуюся кислоту янтарную Объем раствора доводили до метки 0,1 моль/л раствором натрия гидроксида, хорошо перемешивали. Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ – 56 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Параллельно проводили такое же определение с раствором РСО кислоты янтарной. Было установлено, что полученные липосомы характеризуются степенью включения кислоты янтарной 58,5%. Для увеличения этого показателя нами была предпринята попытка введения криопротектора. Было установлено, что максимальное включение (69,7%) наблюдается при использовании 0,2% раствора сахарозы. Для повышения стабильности и достижения максимального включения кислоты янтарной нами предложено использовать сочетание фосфолипида с холестерином. Введение холестерина повышает прочность липосомальной мембраны за счет ограничения подвижности жирнокислотных цепей фосфолипида. Установлено, что при соотношении 1:0,2 наблюдается максимальный эффект включения кислоты янтарной (около 80%).
Определение антиоксидантной активности проводили в опытах in vivo. Эксперимент проводили на беспородных лабораторных крысах обоего пола массой 190 – 280 г в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей [5].
Содержание продуктов перекисного окисления липидов определяли спектрофотометрически по методике И.А. Волчегорского с соавторами [1].
Сущность метода заключается в измерении светопоглощения диеновых коньюгатов, образующихся при переокислении и перегруппировке двойных полиненасыщенных жирных кислот. Наличие максимумов светопоглощения в области 230 – 238 нм позволяет судить о содержании гидроперекисей в липидном экстракте. Максимум светопоглощения в области 260 – 290 нм свидетельствует об окислительной деструкции липидных гидроперекисей.
Определение проводили по методике. В пробирку из химически устойчивого пластика вносили 0,5 мл гомогената ткани в изотоническом растворе, содержащем 0,1% ЭДТА или равный объем ЭДТА- стабилизированной плазмы крови (конечная концентрация ЭДТА в плазме 1 мг/мл). Добавляли 5 мл смеси гептан-изопропанол в объемном соотношении 1:1. Пробирку закрывали пластиковой пробкой, встряхивали и помешали в лабораторный шейкер на 20 минут. Полученный экстракт центрифугировали, переносили в высокие стеклянные пробирки и разбавляли 5 мл смеси гептан-изопропанол (3:7). В разбавленную липидную вытяжку вносили 2 мл раствора хлороводородной кислоты (рН = 2) и оставляли на 30 минут для полного разделения экстракта на фазы. Верхнюю (гептановую) фазу осторожно декантировали ипереносили в отдельную пробирку, избегая частичного смешивания фаз. Водноспиртовую часть липидной вытяжки освобождали от воды и растворенных в ней примесей. Для этого в освобожденный от гептановой фазы экстракт добавляли не менее 1 грамма сухого натрия хлорида. Пробирку встряхивали и оставляли на 30 минут для отстаивания водной фазы. Изопропанольную фазу декантировали, избегая ее контаминации водной фазой. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре СФ – 56 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при трех длинах волн: 220,232 и 278 нм.
Определение содержания конечных продуктов перекисного окисления липидов проводили по вышеуказанной методике, используя в качестве аналитической длины волны 400 нм. Для оценки интенсивности аскорбат-индуцированного ПОЛ к изопропанольным экстрактам добавляли индуцирующую ПОЛ смесь (0,5 мМ аскорбиновой кислоты и 50 мкг сульфата железа). Через 10 минут, когда наблюдается наибольшее изменение содержания молекулярных продуктов липопероксидации, проводили их спектрофотометрическое определение.
Активность каталазы определяли по методу Королюка М.А. Для этого к к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода вносили 0,1 мл изучаемого образца. В холостую пробу вместо сыворотки вносили 0,1 мл воды очищенной и инкубировали при 370С в течение 10 минут, после чего реакцию останавливали добавлением 1 мл 4% раствора аммония молибдата. Интенсивность окраски измеряли на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которой вместо перекиси водорода вносили 2 мл воды очищенной [4].
Результаты и обсуждение
Введение исследуемых веществ проводили в течение 7 дней ректально или перорально в концентрации 100 мг/кг. Параллельно проводили такое же определение с кислотой янтарной. Расчет индексов окисления, отражающих относительный уровень первичных и вторичных продуктов ПОЛ, соответственно, проводили по отношению оптических плотностей Е232/Е220 и Е278/Е220. Относительное содержание шиффовых оснований рассчитывали по отношению поглощения при 400 нм к оптической плотности при 220 нм.
Окисляемость липидных экстрактов оценивали по соотношению величин оптических плотностей Е232/Е220, Е278/Е220, определяемых до и после внесения инициирующей ПОЛ смеси и выражали в процентах по отношению к исходному уровню
Содержание каталазы рассчитывали по формуле:
Е = (Ахол-Аоп)×V×t×K (мкат/л),
где Е – активность каталазы в мкат/л; А – оптическая плотность холостой и опытной проб; V – объем вносимой пробы, 0,1 мл; t – время инкубации, 600 сек; К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный 2,22*103 мМ-1*см-1.
Результаты представлены в табл. 3.
Таблица 1
Составы суппозиторных композиций с янтарной кислотой и экстрактом прополиса
Состав № 1 ПЭГ 4000 – 1,0 Вода очищенная – 1 мл Кремофор – 1,25 Лутрол - 0,75 Кислота янтарная – 0,1 Экстракт прополиса 10% - 0,4 |
Состав № 2 ПЭГ 4000 – 1,0 Вода очищенная – 1 мл Глицерин – 0,5 Лутрол - 1,0 Кислота янтарная – 0,1 Экстракт прополиса 10% - 0,4 |
Состав № 3 Масло какао 2,0 Вода очищенная – 0,5 мл Твин 80 – 0,3 Кислота янтарная – 0,1 Экстракт прополиса – 0,4 |
Состав № 4 ПЭГ 400 – 0,5 ПЭГ 1500 – 0,5 ПЭГ 4000 – 0,5 Кремофор 1,0 Вода очищенная 0,5 Кислота янтарная 0,1 Экстракт прополиса – 0,4 |
Таблица 2
Изучение фармацевтической доступности суппозиториев в опытах in vitro
№ |
Высвобождение кислоты |
Диаметр окрашенной зоны (диффузия в агар), мм |
Время полного растворения/ |
||||||
15 мин |
30 мин |
45 мин |
60 мин |
15 мин |
30 мин |
45 мин |
60 мин |
||
1 |
36,7 |
48,5 |
69,4 |
81,5 |
17 |
19 |
21 |
26 |
19 минут |
2 |
38,4 |
41,7 |
50,9 |
76,5 |
18 |
20 |
21 |
23 |
19 минут |
3 |
12,8 |
38,7 |
54,8 |
76,5 |
14 |
17 |
21 |
23 |
37,50С |
4 |
49,4 |
74,6 |
96,7 |
97,8 |
24 |
27 |
29 |
31 |
18 минут |
Таблица 3
Изменение показателей свободнорадикального окисления
при введении лекарственных форм кислоты янтарной
Показатель |
Контроль |
Кислота |
Суппозитории |
Липосомальная |
Диеновые |
0,496±0,031 |
0,379±0,042 |
0,361±0,012 |
0,349±0,014 |
Кетодиены
(гептановая |
0,201±0,007 |
0,134±0,006 |
0,123±0,011 |
0,119±0,012 |
Шиффовы |
0,135±0,017 |
0,066±0,009 |
0,063±0,008 |
0,062±0,005 |
Диеновые ( изопропанольная фракция) |
0,402±0,014 |
0,228±0,016 |
0,218±0,019 |
0,206±0,018 |
Кетодиены ( изопропанольная фракция) |
0,101±0,016 |
0,098±0,016 |
0,090±0,015 |
0,084±0,016 |
Шиффовы |
0,038±0,009 |
0,0226±0,011 |
0,0207±0,004 |
0,0196±0,008 |
Каталаза, мкат/л |
4,13±0,012 |
4,29±0,018 |
4,38±0,015 |
4,43±0,017 |
Заключение
Проведенные исследования свидетельствуют о том, что кислота янтарная оказывает выраженное антиоксидантное действие, что проявляется в повышении активности каталазы и снижении концентрации диеновых, кетодиеновых и сопряженных диенов, а также шиффовых оснований. Эти изменения статистически значимы по сравнению с данными контрольной группы. Введение природных антиоксидантов экстракта прополиса усиливает антиокислительную активность, устраняя развитие прооксидантного эффекта.