Научный журнал
Успехи современного естествознания
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,775

ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ

Соловьева А.Г. 1
1 ФГБУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии»
Изучены каталитические и кинетические свойства алкогольдегидрогеназы (АДГ) в печени, почках, сердце и легких при экспериментальной термической травме. Исследования проведены на белых крысах линии Wistar. Животным под эфирным наркозом наносили ожог кипятком. В гомогенатах органов на 3, 7, 10 сутки после травмы определяли активность АДГ с использованием в качестве субстрата этилового спирта (прямая реакция) и ацетальдегида (обратная реакция), рассчитывали кинетические характеристики фермента. Полученные результаты свидетельствуют о перераспределении общей активности АДГ в прямой реакции при термической травме. Удельная активность АДГ в обратной реакции, также как и общая, статистически значимо уменьшается во всех органах на 3, 7, 10 сутки после ожога, при этом в печени и легких показано меньшее падение удельной активности фермента, по сравнению с почками и сердцем. Установлено, что статистически значимое изменение удельной активности АДГ в прямой реакции после травмы происходит лишь в печени и почках.
алкогольдегидрогеназа
каталитические и кинетические свойства
ожог
органоспецифичность.
1. Ашмарин И.П. Алкогольдегидрогеназа млекопитающих – объект молекулярной медицины // Успехи биологической химии. – 2003. – Т. 43. – С.3-18.
2. Бардахчьян Э.А., Харланова Н.Г. Структурно-функциональные изменения печени и мозга при эндотоксиновом шоке (ультраструктурное исследование) // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 1997. – №1. – С.17-21.
3. Бардина Л.Р., Сатановская В.И., Пронько П.С., Кузьмич А.Б. Активность ферментов метаболизма этанола и ацетальдегида у крыс с различной изначальной чувствительностью к алкоголю // Украинский биохимический журнал. – 1997. – Т.69, №1. – С.94-98.
4. Давыдов В.В., Швец В.Н. Стимуляция катаболизма эндогенных альдегидов – новое направление в повышении устойчивости организма к стрессу // Украинский биохимический журнал. – 2010. – Т.82, №4 (приложение 2). – С.72.
5. Зимин Ю.В., Соловьева А.Г., Уланова А.А. Оценка кинетических параметров ферментов в гетерогенной надмолекулярной системе // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 2-1. – С. 68-71.
6. Корячкин В.А., Страшнов В.И., Чуфаров В.Н. Интенсивная терапия угрожающих состояний. – СПб.: Санкт-Петербург. мед. изд-во, 2002. – 288 с.
7. Малахова М.Я. Эндогенная интоксикация как отражение компенсаторной перестройки обменных процессов в организме // Эфферентная терапия. – 2000. – Т. 6, № 4. – С. 3–14.
8. Финдлей Дж., Эванз У. Биологические мембраны. Методы / пер. с англ. – М.: Мир, 1990. – 424с.
9. Keung W.M., Ho Y.W., Fong W.P. Isolation and characterization of shrew liver alcohol dehydrogenase // Comp. Biochem. and Physiol. B. – 1989. – Vol. 93, № 1. – P. 169-173.
10. Riveros-Rosas H., Julian-Sanches A., Pina E. Enzymology of ethanol and acetaldehyde metabolism in mammals // Archives of medical research. – 1997. – Vol. 28, № 4. – P. 453 – 471.

Введение

Развивающаяся вследствие термических поражений ожоговая болезнь всегда сопровождается интоксикацией, обусловленной многочисленными неспецифическими токсическими метаболитами [2, 7]. Важнейшим защитным гомеостатическим барьером организма служит система биотрансформации, которая обеспечивает гидрофилизацию ксенобиотиков и эндотоксинов и осуществляется ферментами микросомального и немикросомального окисления. Немикросомальные энзимы – это алкогольдегидрогеназа (АДГ) и альдегиддегидрогеназа.

Главной функцией АДГ является поддержание равновесия во взаимопревращениях эндогенных альдегидов и спиртов. Одним из основных субстратов АДГ служит постоянно образующийся в организме из многочисленных предшественников ацетальдегид [1, 3, 4], который, повреждая ряд энзимов, надмолекулярных образований мембран, индуцирует разнообразные патологические процессы, в том числе модификацию аминогрупп белков с образованием ацетальдегидных аддуктов. АДГ участвует в метаболизме ретиноидов, оксижирных кислот, катаболизме нейромедиаторов, превращениях стероидных гормонов, процессах синтеза холестерина и желчных кислот, детоксикации продуктов перекисного окисления липидов [1]. Постоянно растет число ксенобиотиков, в обезвреживании которых АДГ принадлежит важная роль. При этом в определенных процессах АДГ, напротив, продуцирует повреждающие соединения. Таким образом, исследование регуляторных свойств АДГ в норме и при термической травме является актуальным.

Цель работы – изучение каталитических и кинетических свойств алкогольдегидрогеназы в различных органах крыс при экспериментальном ожоге.

Материалы и методы исследования

Исследования были проведены на белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180-250 г. Животных разделили на две группы: интактная (контрольная, n=8) и опытная (n=10). Под эфирным наркозом крысам опытной группы наносили ожог кипятком на тщательно освобожденных от шерсти 20 %-ах поверхности спины (экспозиция – 3 с), забивали путем декапитации на 3-и, 7-е и 10-е сутки после травмы. Исследования проводили в гомогенатах органов (печень, почки, сердце и легкие) [8]. Активность АДГ определяли с использованием в качестве субстрата этилового спирта (прямая реакция, АДГпр) и ацетальдегида (обратная реакция, АДГобр) по методу W. M. Keung et al. (1989) [9]. Концентрацию белка вычисляли по методу Лоури в модификации. Рассчитывали кинетические характеристики АДГ: Kt – время достижения ½Vmax ферментативной реакции (мин), где Vmax – максимальная скорость накопления продукта реакции (мкмоль/мин); Кa (Vmax/Kt) – коэффициент каталитической эффективности (мкмоль/мин2) [5]. Результаты исследований обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента с помощью программы BIOSTAT.

Результаты и их обсуждение

Полученные результаты показали, что распределение общей активности АДГ в обратной реакции у интактных крыс и у опытных животных на 3-и и 7-е сутки уменьшается в ряду: печень → легкие → почки → сердце (рис. 1), что подтверждает литературные данные [10].

5650.jpg

Рис. 1. Общая активность алкогольдегидрогеназы в обратной реакции в норме и при ожоге

~ – статистически значимо по сравнению с интактными крысами (р≤0,05); * – статистически значимо по сравнению с 3-ми сутками (р≤0,05); ** – статистически значимо по сравнению с 7-ми сутками (р≤0,05).

На 10-е сутки после ожога наблюдается перераспределение общей активности АДГобр (в порядке уменьшения): печень → почки → легкие → сердце. Преобладание АДГобр в почках по сравнению с легкими при термической травме, вероятно, обусловлено более выраженным падением удельной активности АДГобр в легких на 10-е сутки после поражения (табл. 1). Удельная активность, также как и общая, АДГобр статистически значимо уменьшается во всех органах и на всех исследуемых сутках после ожога по сравнению с интактными животными. В печени удельная активность снижается на 16,6 % на 3-и сутки, 38,3 % на 7-е и на 20,2 % на 10-е сутки после травмы (табл. 1).

Таблица 1

Удельная активность АДГ (нмоль НАДН/мин×мг белка) в норме и при ожоге

Орган

Активность

Интактные

крысы

Крысы с ожогом

3 сутки

7 сутки

10 сутки

Печень

АДГпр

47,39±2,55

34,72±1,02#

17,05±1,19 #/*

25,82±1,55 #/*/**

АДГобр

107,90±3,03

89,95±5,49#

66,63±4,53#/*

86,12±3,24#/**

Сердце

АДГпр

17,40±1,95

11,49±2,80

8,52±0,32#

18,46±0,43 */**

АДГобр

65,86±2,18

15,46±1,41#

25,48±2,72#/*

17,53±1,28#/**

Почки

АДГпр

15,25±1,04

32,61±2,85#

29,29±1,27#

49,48±1,14 #/*/**

АДГобр

48,68±2,99

12,91±1,71#

14,91±0,98#

33,36±1,14#/*/**

Легкие

АДГпр

84,13±3,87

96,38±12,15

64,90±3,82#/*

72,80±2,75#

АДГобр

122,10±8,85

50,44±4,77#

67,40±1,62#

60,47±1,49 #/*/**

Примечания: # – статистически значимо по сравнению с интактными крысами (р≤0,05); * – статистически значимо по сравнению с 3-ми сутками (р≤0,05); ** – статистически значимо по сравнению с 7-ми сутками (р≤0,05).

Максимальное снижение активности в печени, обусловленное статистически значимым выраженным увеличением Kt в 1,9 раз, наблюдается на 7-е сутки после ожога, в отличие от других органов с наибольшим падением активности фермента на 3-и сутки, свидетельствуя о том, что печень позднее реагирует на эндогенную интоксикацию. На 3-и и 10-е сутки после ожога Kt возрастает в 1,2 и 1,5 раза соответственно (табл. 2). В легких удельная активность АДГобр снижается на 58,7 % на 3-и сутки, 44,8 % на 7-е сутки и 50,5 % на 10-е сутки после травмы. Из данных табл. 2 видно, что Kt для АДГобр в легких увеличивается в 3,7 раза на 3-и сутки и в 2,8 раз на 7-е и 10-е сутки. В сердце удельная активность АДГобр уменьшается в наибольшей степени (на 76,5 %) на 3-и сутки, на 61,3 % на 7-е сутки и на 73,4 % на 10-е сутки после термической травмы. При этом Kt для АДГобр статистически значимо увеличивается на 3-и сутки в 1,3 раза и в 1,4 раза на 10-е сутки, что свидетельствует о снижении сродства фермента к субстрату. Кa уменьшается в 3,9 раз на 3-и сутки и в 3,4 раза на 7-е и 10-е сутки после ожога (табл. 2).

Таблица 2

Кинетические характеристики АДГ у интактных крыс и крыс с ожогом

Показатель

Интактные крысы

Крысы с ожогом

3 сутки

7 сутки

10 сутки

Kt,

мин

печень

АДГпр

1,45±0,12

1,77±0,08#

2,70±0,05#/*

2,17±0,11#/*/**

АДГобр

2,76±0,06

7,45±0,33#

15,45±2,15#/*

9,44±1,05#/*/**

сердце

АДГпр

3,25±0,18

3,40±0,05

4,71±0,82#/*

3,35±0,37

АДГобр

0,96±0,04

1,27±0,07#

1,03±0,05*

1,30±0,07#/**

почки

АДГпр

2,03±0,05

0,85±0,06#

1,23±0,09#/*

0,75±0,04#/**

АДГобр

1,06±0,03

2,00±0,05#

1,51±0,13#/*

1,25±0,03#/*/**

легкие

АДГпр

1,37±0,18

1,60±0,05

2,00±0,09#/*

2,00±0,02#/*

АДГобр

0,61±0,04

2,25±0,12#

1,70±0,02#/*

1,70±0,05#/*

Ka,

мкмоль/

мин2

печень

АДГпр

0,97±0,04

0,24±0,01#

0,24±0,02#

0,80±0,08*

АДГобр

1,21±0,08

0,87±0,01#

1,23±0,12*

0,82±0,05#/**

сердце

АДГпр

0,34±0,02

0,28±0,01#

0,45±0,04#/*

0,39±0,04*

АДГобр

0,82±0,06

0,21±0,02#

0,24±0,02#

0,24±0,03#

почки

АДГпр

0,56±0,03

0,25±0,00#

0,31±0,03#

0,54±0,02*/**

АДГобр

0,37±0,01

0,10±0,00#

0,67±0,02#/*

0,18±0,02#/*/**

легкие

АДГпр

0,15±0,00

0,09±0,01#

0,06±0,00#/*

0,04±0,00#/*/**

АДГобр

0,33±0,01

0,26±0,03

0,04±0,00 #/*

0,14±0,01 #/*/**

Примечания: # – статистически значимо по сравнению с интактными крысами (р≤0,05); * – статистически значимо по сравнению с 3-ми сутками (р≤0,05); ** – статистически значимо по сравнению с 7-ми сутками (р≤0,05).

Согласно литературным данным, с одной стороны, главной причиной патологических изменений миокарда является ожоговая интоксикация [7]. С другой стороны, поражения миокарда при термической травме лишены специфичности. Поводом для их появления является несоответствие между количеством притекающей к сердцу крови и функциональной потребностью в ней, что постоянно создается при ожоге, сопровождающемся рефлекторными нарушениями регуляции кровообращения.

В почках также происходит падение активности АДГобр (на 73,5 % на 3-и сутки, на 69,4 % на 7-е сутки, на 31,5 % на 10-е сутки), которое сопровождается уменьшением сродства АДГ к субстрату и статистически значимым увеличением Kt в 1,9 раз на 3-и сутки, 1,4 раза на 7-е и в 1,2 раза на 10-е сутки после термической травмы. Ka снижается в 3,7 раза на 3-и, в 2,0 раза на 10-е сутки (табл. 2). В.А. Корячкин и др. (2002) высказали предположение, что нарушение функции почек при ожогах может иметь своей причиной воздействие токсических продуктов на их паренхиму и уменьшение притока крови к органу [6].

Полученные результаты говорят о пропорциональном изменении Kt и активности АДГобр во всех исследуемых органах – чем больше увеличивается время достижения ½ Vmax, тем интенсивнее снижается активность фермента. Уменьшение активности АДГобр, вероятно, связано с изменением физиологических особенностей организма после ожога, развитием полиорганной недостаточности, которая, по мнению М.Я. Малаховой, сопровождает ожоговую травму и, возможно, именно обратная реакция алкогольдегидрогеназы наиболее чувствительна к недостаточности кровоснабжения и гипоксии в органах, а также к эндогенной интоксикации организма [7]. Понижение активности АДГобр при термической травме приводит к накоплению во всех исследуемых органах высокотоксичных альдегидов, ацеталей и кетонов. Особенно это характерно для почек, в которых при ожоге при снижении активности АДГобр статистически значимо возрастает активность АДГпр.

Распределение общей активности АДГ в прямой реакции у крыс контрольной группы соответствует литературным данным [10] и уменьшается в ряду: печень → легкие → почки → сердце (рис. 2). У животных с ожогом на 3-и и 7-е сутки после термической травмы наибольшая активность АДГпр регистрируется в легких, затем в почках, в печени и наименьшая в сердце. Преобладание активности фермента в легких по сравнению с другими органами сопровождается более высокими абсолютными значениями удельной активности в легких (табл. 1). На 10-е сутки после ожога активность АДГпр уменьшается в ряду: почки → печень→легкие → сердце. Данное распределение обусловлено нарушением функциональной активности почек из-за избыточного поступления в них токсических веществ и ростом каталитической активности АДГпр.

5590.jpg

Рис. 2. Общая активность алкогольдегидрогеназы в прямой реакции в норме и при ожоге

~ – статистически значимо по сравнению с интактными крысами (р≤0,05); * – статистически значимо по сравнению с 3-ми сутками (р≤0,05); ** – статистически значимо по сравнению с 7-ми сутками (р≤0,05).

В печени крыс удельная активность АДГпр уменьшается на 26,7 % на 3-и сутки, 64,0 % на 7-е сутки и на 45,5 % на 10-е сутки после ожога по сравнению с контрольной группой крыс, приводя к снижению детоксикационной функции данного органа. Снижение активности АДГ в печени обожженных крыс, вероятно, связано с трансформацией клеточных ультраструктур (митохондрий, рибосом, лизосом). Повреждение митохондрий клеток печени, разобщение в них фосфорилирования и дыхания, возникающие вследствие нарушений кровообращения при ожоге, а также действия токсических веществ, являются причиной изменения активности большинства ферментов данного органа [2, 7].

Кроме структурных и функциональных трансформаций в органах при ожоге, нарушение активности АДГпр происходит и за счет статистически значимых изменений кинетических параметров фермента. В печени выявлено уменьшение сродства АДГпр к субстрату (Kt увеличивается в 1,9 раз на 7-е сутки, в 1,5 раза на 10-е сутки), снижение Кa в 4,0 раза на 3-и и 7-е сутки после поражения. Повышение удельной активности АДГпр в почках (в 2,0 раза на 3-и сутки, в 1,9 и 3,2 раза на 7-е и 10-е сутки) обусловлено снижением Kt в 2,4 раза на 3-и сутки, 1,7 раз на 7-е, в 2,7 раз на 10-е сутки после термической травмы. В сердце удельная активность АДГпр снижается на 51,1 % на 7-е сутки, при этом увеличивается Kt в 1,5 раза (табл. 1, 2). В легких активность АДГпр статистически значимо уменьшается на 22,9 % на 7-е сутки, на 13,5 % на 10-е сутки после ожога по сравнению с интактными животными на фоне роста Kt в 1,5 раза и уменьшения Ka в 2,5 и 3,75 раза на 7-е и 10-е сутки (табл. 2).

Вычисленное соотношение удельных активностей АДГпр/АДГобр у интактных крыс составило: в печени – 0,44, в сердце – 0,26, в почках – 0,31, в легких – 0,70. Полученное значение меньше единицы говорит о преобладании обратной реакции. При термической травме в печени отмечено снижение соотношения на всех исследуемых сутках после ожога, что свидетельствует о накоплении этанола. В сердце, почках и легких на 3-и, 7-е и 10-е сутки после поражения данное соотношение выше показателя интактных крыс, что приводит к повышению высокотоксичных альдегидов.

Таким образом, в печени и легких регистрируется меньшее падение активности АДГобр (< 60 %) на всех сутках после ожога, по сравнению с уменьшением активности в почках (> 60 %, кроме 10-х суток) и сердце (> 60 %). Показано, что статистически значимое изменение удельной активности АДГпр после термической травмы происходит лишь в органах, принимающих наибольшее участие в нейтрализации токсинов – в печени и почках.


Библиографическая ссылка

Соловьева А.Г. ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ // Успехи современного естествознания. – 2014. – № 9-2. – С. 28-32;
URL: https://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=34348 (дата обращения: 29.03.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674