Научный журнал

Успехи современного естествознания

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

• Авторы
• Резюме
• Файлы

Архипов С.А.

На основе сравнительного цитоморфологического анализа макрофагов и эпителиоидных клеток, формирующихся в культуре, и данных научной литературы рассматриваются вопросы, касающиеся проблемы происхождения эпителиоидных клеток и их морфологической идентификации.

Статья в формате PDF

120 KB

Известно, что морфологическим проявлением многих гранулематозных болезней является хроническое воспаление с формированием эпителиоидноклеточных гранулем (1-4,6,9,15). Большинство исследователей придерживаются точки зрения о том, что эпителиоидные клетки формируются из макрофагов (3,13,14,15). Однако существуют и другие точки зрения, указывающие на то, что эпителиоидные клетки могут дифференцироваться из моноцитов (5,10,12), минуя фазу дифференцирования в макрофаги, или из отдельной эпителиоидно-клеточной линии, гистогенетически не зависимой от макрофагальной линии клеток (1). В настоящее время на основе результатов гистологических и цитологических исследований по морфологическим критериям выделяют три типа эпителиоидных клеток: плазмоцитоидные (тип А), везикулированные (тип В) и фибробластоподобные (1-4,8,9,15). Однако биологическая сущность эпителиоидных клеток, особенности их происхождения и дифференцировки, а также их роль в патологических процессах еще во многом не ясны. Таким образом, выяснение новых цитоморфологических особенностей эпителиоидных клеток и комплексных критериев их идентификации in situ и in vitro с учетом различных концептуальных аспектов их происхождения может представлять не только теоретический, но и практический интерес.

Материалы и методы. Эксперименты проводили на мышах, полученных из лаборатории экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск): самках линии BALB/c 6-8-нед. возраста, массой 20-22 г. Суспензии перитонеальных клеток получали из перитонеального транссудата мышей и культивировали на покровных стеклах в чашках Петри по описанному ранее методу (1). Гранулы зимозана (Олайнского завода химреактивов) вносили в количестве 1,5х10⁷ на культуру (6х10⁶ клеток). Культуры клеток окрашивали основным фуксином для исследования методом цветного интерференционного контраста, азур-эозином - для исследования в проходящем и отраженном свете (1). Изображения клеток передавали с объектива микроскопа на объектив видеокамеры Sony TR 330, подключенной к видеоконтрольному устройству ВК 23В60 (Россия), на экран которого (126 х 169 мм) была нанесена сетка, градуированная таким образом, чтобы при максимальном рабочем увеличении на микроскопе цена одного деления составляла 1 мкм. Площади, занимаемые клетками и их ядрами, подсчитывали по формуле: S = N x A + (M x A)/2, где N - количество полных квадратов, совмещенных с изображением, М - количество квадратов, частично совмещенных с изображением, А - площадь квадрата морфометрической сетки. Достоверность различий между сравниваемыми средними величинами оценивали при помощи непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение. В ряде работ показано, что в культурах тканей и клеток, содержащих макрофаги или моноциты, эпителиоидные клетки выявляются на 1-2-й неделе после начала культивирования (5,12,13,14). Вместе с тем морфологические особенности клеток с эпителиоидным фенотипом и их отличия от клеток макрофагального типа in vitro не были четко дифференцированы.

В результате проведенного исследования установлено, что уже на 3-5-е сутки культивирования в культурах перитонеальных клеток интактных мышей, инкубируемых с зимозаном, выявляются крупные эпителиоидные клетки трех типов: везикулированные, плазмоцитоидные и фибробластоподобные. Доминировали плазмоцитоидные клетки (95,5 %). При анализе большого массива эпителиоидных клеток (10⁵), формирующихся в культуре, обнаружено, что значительная их часть (более 50 %) на 7-е сутки культивирования находятся в кластерах, состоящих из 3 и более (до 50) однотипных клеток полигональной формы, плотно прилегающих друг к другу. На 1-е сутки культивирования выявлены относительно небольшие (сравнимые с макрофагами по размерам) клетки плазмоцитоидного типа (некоторые из них с признаками кариокинеза и цитотомии). Эти клетки по целому ряду качественных морфологических особенностей можно отнести к переходным или незрелым формам клеток-предшественниц эпителиоидных клеток. Условно они были названы "юными" эпителиоидными клетками. В результате сравнительного цитоморфологического анализа эпителиоидных клеток и макрофагов in vitro установлено, что по целому ряду количественных и качественных морфологических критериев клетки эпителиоидного типа в значительной степени отличаются от макрофагов (таблицы 1-2).

Таблица 1. Результаты морфометрического исследования эпителиоидных клеток и макрофагов в культурах перитонеальных клеток, инкубированных с гранулами зимозана.

Примечание. Анализу подвергалось 500 эпителиоидных клеток и 500 макрофагов (фагоцитировавших гранулы зимозана) на 7-е сутки культивирования. Результаты представлены в виде x±s (%), где x - средняя арифметическая, s - стандартная ошибка. Достоверность различий между показателями - *p<0,01; **p<0,001.

Таблица 2. Качественные цитоморфологические особенности макрофагов и клеток эпителиоидного типа, формирующихся в культурах перитонеальных клеток.

Примечание. Анализу подвергалось 500 эпителиоидных клеток и 500 макрофагов (фагоцитировавших гранулы зимозана) на 7-е сутки культивирования ("юные" эпителиоидные формы оценивали на 2-е сутки). Степень выраженности признаков в популяциях клеток: "-" - признак не выявляется у всех клеток; "±" - встречается у единичных клеток; "+" - менее, чем у 50 % клеток; "++" - более, чем у 50 % клеток; "+++" - у всех клеток. В таблицу включены только наиболее важные для морфологической идентификации клеток варианты оцениваемых качественных признаков.

К одному из ключевых и важных аспектов изучения морфогенеза эпителиоидно-клеточных гранулем, непосредственно связанных с проблемой происхождения эпителиоидных клеток, следует отнести вопрос о механизмах формирования в макрофагальных гранулемах эпителиоидно-клеточных кластеров. Согласно общепринятой концепции происхождения эпителиоидных клеток из макрофагов невозможно заранее предсказать какой макрофаг будет трансформироваться в эпителиоидную клетку. Если исходить из современных представлений о механизмах детерминации полустволовых клеток в различных направлениях клеточной дифференцировки, то процесс индукции клеток-предшественниц какого-либо гистогенетического ряда подчиняется стохастическим законам. Различные колониестимулирующие факторы не определяют направление дифференцировки, а изменяют вероятность того или иного поведения клетки (7,11). Возможно именно эти общие положения о вероятностных механизмах клеточной индукции и детерминации помешали целенаправленному поиску переходных форм от макрофагов к эпителиоидным клеткам не только в экспериментах in vitro, но и in vivo, поскольку с точки зрения теории вероятности решить указанную задачу не представляется возможным. Тем не менее, нами впервые была предпринята попытка выявить по морфологическим критериям субпопуляцию мононуклеарных клеток, обладающих определенными потенциями к дифференцировке в эпителиоидные клетки.

Были сформулированы две рабочие гипотезы появления в культурах перитонеальных клеток кластеров, состоящих из эпителиоидных клеток. Согласно первому предположению можно было ожидать, что такие высокодифференцированные и высокоспециализированные клетки как макрофаги, с ограниченными потенциями к делению, могут приобретать в процессе трансформации в эпителиоидные клетки способность к активной пролиферации и претерпевать дедифференцировку. Согласно второй гипотезе механизм образования эпителиоидно-клеточных кластеров в культуре клеток мог быть обусловлен существованием своего рода цепной реакции (эффектом "падающего домино"), когда одна зрелая дифференцированная эпителиоидная клетка стимулирует процессы индукции близлежащих макрофагов, включающих механизмы трансформации этих клеток в эпителиоидно-клеточном направлении. Обе эти гипотезы были отвергнуты после первых же экспериментов in vitro, поскольку в составе эпителиоидно-клеточных кластеров не было выявлено ни одной клетки, которую можно было бы рассматривать как дедифференцированную или как переходную форму от макрофага к клетке эпителиоидного типа. Более того, было установлено, что в культурах перитонеальных клеток интактных мышей, инкубированных с зимозаном, на 7-е сутки культивирования общее количество единиц эпителиоидно-клеточного формообразования (сумма отдельно отстоящих эпителиоидных клеток и эпителиоидно-клеточных кластеров) достоверно не отличается от количества "юных" эпителиоидных клеток, выявляемых в первые сутки культивирования. Прижизненные (в микрокамерах) наблюдения за процессом формирования эпителиоидно-клеточных кластеров позволили сделать заключение, что прирост клеток в кластерах осуществляется прямым делением ядер эпителиоидных клеток, находящихся преимущественно на периферии кластеров, с последующей цитотомией. Эпителиоидные клетки в составе кластеров приобретали черты типичных эпителиальных клеток, формирующих монослой (по морфологии, расположению и характеру клеточного роста).

Следует подчеркнуть, что ни в одном эксперименте in vitro не было выявлено ни одного случая фагоцитоза гранул зимозана эпителиоидными клетками. Напротив, большинство клеток макрофагального типа фагоцитировали гранулы зимозана. Поскольку зимозан вносили в самом начале культивирования, то было очевидно, что клетки-предшественницы эпителиоидных клеток и их переходные формы не обладают фагоцитозной активностью (по крайней мере в отношении гранул зимозана). Вместе с тем было установлено, что в некоторых случаях гранулы зимозана "проникают" в цитоплазму эпителиоидных клеток в результате слияния этих клеток с макрофагами, фагоцитировавшими зимозан, то есть при формировании симпластоподобных клеточных образований.

В результате проведенного исследования можно сделать следующее заключение. Цитоморфологические различия между макрофагами и эпителиоидными клетками, выявленные в культурах перитонеальных клеток, настолько очевидны и существенны, что с учетом закономерностей формирования in vitro клеток с эпителиоидным фенотипом и особенностей морфогенеза эпителиоидно-клеточных кластеров позволяют рассматривать эпителиоидные клетки и макрофаги как гистогенетически и функционально дивергентные клеточные формы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Архипов С.А. Эпителиоидная клетка. Новая концепция происхождения и дифференцировки. Новосибирск: Наука, 1997. 88 с.
2. Ерохин В.В. Функциональная морфология респираторного отдела легких. М.: Медицина, 1987. 270 с.
3. Струков А.И., Кауфман О.Я. Гранулематозное воспаление и гранулематозные болезни. М.: Медицина, 1989. 184 с.
4. Шкурупий В.А., Курунов Ю.Н., Яковченко Н.Н. и др. // Бюлл. СО РАМН. 2000. № 1. С.62.
5. Arai K., Mizuno K., Yamada T. et al. // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 1999. V.9. P. 21.
6. Bouley D. M., Ghori N., Mercer K. L. // Infection and Immunity. 2001. V. 69. № 12. P. 7820.
7. Dexter T.M., Spooncer E. // Annu. Rev. Cell. Biol. 1987. V. 3. P. 423.
8. Horiuchi Y.; Masuzawa M. // J. Dermatol. 1995. V. 22. № 9. P. 643.
9. Koizumi H., Matsumura T., Kumakiri M. et al. // Nip. Hif. Gakk. Zasshi. 1990. V.100. № 8. P. 871.
10. Lee J. Y., Atochina O., King B. et al. // Infection and Immunity. 2000. V. 68. № 7. P. 4032.
11. Metcalf D. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1980. V. 77. P. 5327.
12. Ohta M., Okabe T., Ozawa K. et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1986. V. 465. P. 211.
13. Rhee N.J., Van Burgh C.P., Daems W.T. // Cell. Tiss. Res. 1979. V. 197. № 3. P. 355.
14. Seitzer U., Haas H., Gerdes J. // Histol. Histopathol. 2001. V.16. №2. P. 645.
15. Turk J.L., Narayanan R.B. // Immunobiology. 1982. V.161. №3. P. 274.

Библиографическая ссылка