Научный журнал
Успехи современного естествознания
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,823

РАЗРАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИК АНАЛИЗА НЕКОТОРЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИЗОНИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ И ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Чекулаева Г.Ю. 1 Громова З.Ф. 1
1 ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
В статье представлены материалы по разработке методики анализа производного изоникотиновой кислоты – изониазида – спектрометрическим методом в фармацевтической субстанции, лекарственных формах и биологической жидкости. Описана аналитическая процедура для экспрессного определения изониазида в моче. Предлагаемая методика позволяет косвенно определить активность N-ацетилтрансферазы с целью индивидуализации дозы лекарственных препаратов. Диапазон количественного определения от 0,0012 г/мл до 0,0027 г/мл. Валидация методики показала, что данная методика не содержит грубой и системной ошибки, позволяет получить воспроизводимые результаты и может быть использована как в фармацевтических, так и в фармакокинетических исследованиях.
изониазид
методы анализа
спектрофотометрия в видимой области
экспресс-анализ
химико-токсикологический анализ биологической жидкости
1. Государственная фармакопея XI издания. – М.: Медицина, 1987. – Вып. 1. – 334 с.
2. Государственная фармакопея Российской Федерации. – 12-е изд. – М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. – 704 с.
3. Машковский М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. – 15-е изд., перераб., испр. и доп. – М.: РИА «Новая волна». 2007. – 1206 с.
4. Мелентьев А.Б. Определение изониазида в трупной крови и плазме методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектором. / А.Б. Меленьев, А.В. Лаврентьева. – Суд.мед. экспертиза. – 2011. – № 4. – С. 23–27.
5. Фартушный А.Ф. Хроматоспектрофотометрическое определение производных изоникотиновой кислоты в биологическом материале. / А.Ф. Фартушный. – Суд.мед. экспертиза. – 1981. – № 4. – С. 42–44.
6. Электрон.дан. – Режимдоступа: http://slon/biz 1037105 ammo 1. livejournal.com.

В настоящее время увеличивается число людей, страдающих туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью. По данным ВОЗ ежедневно около 1000 человек в европейском регионе заражаются туберкулезом, в том числе мультирезистентным, и только 50 % из них удается успешно вылечить. Ситуация требует расширения доступа к безопасным и эффективным препаратам, а также инновационного подхода к экспресс-диагностике и лечению туберкулеза, исходя из каждого индивидуального случая [6].

Современная фармакотерапия туберкулеза предусматривает комплексное использование специфических антибактериальных препаратов и лекарственных средств разных фармакологических групп (иммуномодуляторов, гормональных препаратов, муколитических средств и др.). К препаратам 1 ряда, являющимся основными химиотерапевтическими средствами для лечения различных форм туберкулеза, относятся изониазид, его производные, антибиотики, пара-аминосалициловая кислота и ее производные. Основные препараты, особенно в виде комбинаций, применяют преимущественно при впервые выявленном туберкулезе. Курс лечения составляет от 3-х до 6-ти месяцев. Вместе с тем необходимо учитывать, что действие противотуберкулезных препаратов сопровождается обычно побочными эффектами, выраженность которых может возрастать при их одновременном применении [3].

Изучение фармакокинетики химиотерапевтических препаратов особенно важно в процессе химиотерапии туберкулеза, так как для достижения эффекта необходимо длительное лечение, что может привести к повышению чувствительности к применяемым лекарственным веществам. Кроме того, процесс лечения требует постоянного контроля за содержанием противотуберкулезных препаратов в крови, распределением их в организме и выведением для предотвращения передозировки. Это особенно актуально при нарушении функции почек, так как в этих случаях может наблюдаться задержка выведения противотуберкулезных средств и их кумуляция. Во многих случаях необходимо индивидуализировать дозы лекарственных препаратов с учетом их растворимости, всасываемости, интенсивности инактивации, скорости выведения, что зависит от активности фермента N-ацетилтрансферазы (NAT). Под действием фермента происходит биотрансформация (в частности, процесс ацетилирования) противотуберкулезных лекарственных средств, что приводит к увеличению растворимости получаемых метаболитов в воде и ускоренному выведению из организма почками.

Метаболизм изониазида представлен на схеме:

chek1.tif

Следует отметить, что активность NAT у разных людей генетически отличается, поэтому метаболизм может быть или быстрым или медленным. Знание относительной индивидуальной активности NAT может позволить оптимизировать режимы дозирования противотуберкулезных лекарственных средств и оценить риск их воздействия на организм. Активность фермента NAT можно определить косвенным методом по исследованию фармакокинетики тест-препарата ацетилирования – изониазида.

Для количественного определения изониазида в субстанции ГФ XII издания рекомендует объемный метод кислотно-основного титрования в неводных средах, используя его основные свойства. Навеску лекарственного средства титруют хлорной кислотой в среде ледяной уксусной кислоты и уксусного ангидрида [2]. Метод связан с достаточно большими временными затратами, с необходимостью использования летучих агрессивных реактивов, а также имеются ограничения его применения для токсико-кинетических исследований.

На сегодняшний день существуют другие способы детектирования содержания тест-препарата ацетилирования – изониазида методами масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, флуориметрии. Однако эти методы имеют ряд существенных недостатков, таких как высокая стоимость, методическая сложность и длительность проведения исследования [4, 5].

Таким образом, актуальной является разработка экспрессной методики количественного определения данного лекарственного средства в субстанции, обладающей высокой чувствительностью. Она позволит провести количественное определение изониазида не только в лекарственных формах, но и в биологических жидкостях организма человека (моча), что необходимо при фармакокинетических исследованиях с целью определения активности фермента NAT.

Целью нашего исследования является разработка простой в использовании, экспрессной и валидизированной методики количественного определения изониазида не только в фармацевтических субстанциях, но и в биологических объектах. В основе спектрофотометрического метода количественного определения в видимой области спектра, была использована реакция изониазида с метаванадатом аммония в среде хлороводородной кислоты. Реакция основана на способности соединений ванадия (V) образовывать окрашенные комплексы с органическими лигандами, имеющими в своей структуре определенные функциональные группы, содержащие атомы азота и кислорода (гидразидная группа).

Для достижения поставленных целей необходимо решить следующие задачи:

1. Осуществить выбор рабочей длины волны.

2. Определить линейную зависимость между концентрацией фармацевтической субстанции к оптической плотности продукта реакции с аммония ванадатом.

3. Установить время устойчивости окраски.

4. Определить чувствительность реакции с целью возможности использования её при химико-токсикологических исследованиях.

5. Определить диапазон подчинения продукта реакции основному закону светопоглощения.

6. Провести количественное определение изониазида в фармацевтической субстанции, лекарственной форме и биологической жидкости (моче).

Материалы и методы исследования

Все исследования проводили на фотометре КФК-3 в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм при комнатной температуре. В анализе использовали рабочий стандартный образец (РСО) изониазида (ФС 42-0236-07). Приготовление стандартного рабочего раствора: 0,12 г изониазида (точная навеска) помещали в мерную колбу емкостью 100 мл, растворяли в воде, доводили водой до метки, тщательно перемешивали. 25 мл полученного раствора переносили в мерную колбу емкостью 100 мл, доводили водой до метки, тщательно перемешивали.

Статистическую обработку экспериментальных данных исследований (р = 95 %) проводили с помощью программ StatSoft Statistica 6,0, Microsoft Excel с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата и определением ошибки единичного определения [1].

Результаты исследования и их обсуждение

Для выбора рабочей длины волны готовили раствор изониазида с концентрацией 0,0003 г/мл. По истечении 5 минут измеряли оптическую плотность окрашенного продукта реакции при разных длинах волн, относящихся к видимой области спектра (380 нм – 780 нм).

Спектр поглощения раствора изониазида в видимой области имеет максимум при длине волны 430 нм. При той же длине волны проводили измерения оптической плотности испытуемых растворов и растворов сравнения.

Результаты определения устойчивости окраски во времени представлены в табл. 1. Из данных таблицы видно, что в течение 30 минут окраска оставалась устойчивой.

Для выявления линейной зависимости между концентрацией фармацевтической субстанции изониазида и оптической плотностью продукта его реакции с метаванадатом аммония готовили ряд разведений в широком диапазоне концентраций – от 0,0012 г/мл до 0,0027 г/мл. Проведенные исследования позволяют сделать заключение, что в выбранном интервале концентраций изониазида наблюдается подчинение закону Бугера – Ламберта – Бера.

Относительная погрешность определения находилась в пределах точности спектрофотометрического анализа.

Минимальная концентрация изониазида, определяемая по этой методике, составляет 0,0012 г/мл, что свидетельствует о возможности ее применения не только для анализа фармацевтических препаратов, но и для определения изониазида в биологических объектах.

Следующим этапом исследования явилось определение содержания изониазида в фармацевтической субстанции и лекарственной форме. Определение проводили в сравнительном аспекте с раствором стандартного образца, поскольку данный метод определения является более точным, надежным и отвечает требованиям Государственной Фармакопеи XII издания. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Как следует из приведенных в таблице данных, полученные результаты укладываются в нормы допустимых отклонений.

Таблица 1

Зависимость оптической плотности окрашенного комплекса от времени

Объем раствора изониазида и его концентрация, г/мл

Длина волны, нм

Оптическая плотность

5 мин

10 мин

15 мин

20 мин

25 мин

30 мин

6 мл;

0,0018 г/мл

430

0,458

0,458

0,457

0,457

0,456

0,455

Таблица 2

Результаты определения изониазида в фармацевтической субстанции и лекарственной форме

№ опыта

Объект исследования

Найдено

Нормы допустимых отклонений

Метрологическая

характеристика

1

2

3

4

5

Фармацевтическая субстанция изониазида

99,98

100,20

99,96

99,98

99,98

Не менее 99,9 %, не более 101,0 %

Хср = 100,02

S = 0,1009

Sxср = 0,4512

Ε = 0, 0125

εa = 100,02 ± 1,25

1

2

3

4

5

Таблетки изониазида по 0,3 г

0,292

0,299

0,300

0,292

0,299

[0,285÷0,315]

Хср = 0,297

S = 0,0041

Sxср = 0,0018

Ε = 0,017

εa = 0,297 ± 0,017

Валидация методики показала, что данная методика не отягощена грубой и системной ошибкой, является правильной и позволяет получить воспроизводимые результаты.

Разработанная методика была применена в химико-токсикологическом исследовании изониазида в моче в качестве биологической жидкости.

Для приготовления модельной смеси использовали образец мочи, полученный от здорового добровольца. При этом в течении месяца до отбора проб человек не принимал лекарств. Модельные смеси мочи готовили путем добавления к ней определенного объема стандартного раствора изониазида с концентрацией 0,0003 г/мл. Приготовленные смеси выдерживали в течение 24 часов при комнатной температуре.

Изучено влияние окраски реактива метаванадата аммония и мочи на величину молярного коэффициента поглощения комплекса изониазида с метаванадатом аммония. Для этого были получены спектры метаванадата аммония, смеси метаванадата аммония с мочой и образца мочи. Как показали исследования, при длине волны, равной 430 нм, влияние реагента незначительно и его можно нивелировать, если включить все компоненты в раствор сравнения при спектрофотометрическом определении в видимой области спектра. Количественное определение изониазида в моче проводили спектрофотометрическим методом по методике, разработанной для фармацевтической субстанции исследуемого лекарственного средства. Определение изониазида в моче оценивалось методом «введено – найдено». Предел обнаружения изониазида при указанных условиях спектрофотометрического определения – 0,6 мг/мл.

Выводы

Разработана методика количественного определения изониазида в фармацевтической субстанции, лекарственной форме и биологической жидкости спектрофотометрическим методом в видимой области спектра. Показана возможность использования данной методики в дальнейших химико-токсикологических исследованиях.


Библиографическая ссылка

Чекулаева Г.Ю., Громова З.Ф. РАЗРАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИК АНАЛИЗА НЕКОТОРЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИЗОНИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ И ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИЯХ // Успехи современного естествознания. – 2015. – № 11-1. – С. 98-101;
URL: http://www.natural-sciences.ru/ru/article/view?id=35680 (дата обращения: 22.04.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074