Для борьбы с гипоксией сегодня рекомендуется применять антигипоксанты, то есть средства «против гипоксии». При этом современные антигипоксанты не являются заменителями, аккумуляторами или донаторами кислорода, поэтому на основе классических законов химии, биохимии, биофизики и биологии трудно себе представить, как такие средства могут заменить кислород и побороть гипоксию [6]. Более того, исходя из указанных представлений, эти средства не могут продлевать жизнь человека и животных в условиях гипоксии [10, 12]. А как же на самом деле ?
Ответ этот вопрос следует искать в области фармакологии. В этой сфере деятельности в настоящее время к антигипоксантам относят такие лекарственные средства, как дибунол, оксибутират натрия, олифен, эпофен, эмоксипин, мексидол, мафусол и реамберин [6]. Считается, что механизм действия этих лекарств сводится к способности эффективно защитить от гипоксического повреждения чуть ли не весь организм, включая клетки коры головного мозга. Тем не менее, эти средства не применяются для сохранения жизнеспособности изолированных органов и тканей при их консервации, которая осуществляется в условиях недостатка кислорода, то есть в условиях гипоксии [1, 2, 3]. В связи с этим возникает обоснованное сомнение в истинной способности этих средств повышать устойчивость к гипоксии у органов, тканей и организма в целом.
Иными словами, имеющиеся факты противоречат другим. С одной стороны, гипоксия – это недостаток кислорода, с другой стороны, современные антигипоксанты – это не кислород и не его заменители, а соли, лишенные кислорода. При этом известно и то, что живые органы, ткани и организмы могут быть защищены от гипоксического повреждения без добавления кислорода. Парадоксально то, что победа над гипоксией без кислорода возможна довольно просто, а именно – с помощью охлаждения биологических объектов [2, 4, 5, 9].
На наш взгляд, сохранение неразрешенных проблем в поиске и изучении антигипоксантов объясняется тем, что исследователи до сих пор не имеют в своих руках простой и дешевой экспериментальной модели, которая бы позволяла оценивать устойчивость организма к гипоксии с учетом недостатка кислорода, зависимости аэробного метаболизма от температуры и устойчивости организма к гипоксии.
Результаты анализа истории изучения антигипоксантов показывают, что приведенные выше противоречия остаются неразрешенными еще и потому, что особенности гипоксических повреждений длительное время изучались в опытах на теплокровных животных. А теплокровные животные не допускают «свободного» (то есть беспрепятственного) искусственного изменения температуры их тела, поскольку при искусственном охлаждении они борются как с общей, так и с локальной гипотермией и реагируют на попытки искусственного изменения температуры их тела как на повреждающий фактор. Однако сегодня методологическая основа изучения устойчивости живых объектов к гипоксии может быть существенно оптимизирована благодаря появлению новой модели в области термофармакологии, а именно – в области изучения эффективности антигипоксантов. Дело в том, что для изучения проблем термофармакологии предложено использовать аквариумных рыбок, допускающих «беспрепятственное» изменение температуры своего тела, поскольку рыбы относятся к холоднокровным животным [7,8].
Цель исследования: разработка способа скрининга гипоксантов и антигипоксантов.
Материалы и методы исследования.
Опыты с острой и потенциально смертельной гипоксией проведены на 300 взрослых здоровых аквариумных рыбках обоего пола породы голубые неоны (150 рыбок) массой по 290-310 мг и гуппи (150 рыбок) массой по 300-320 мг. Моделирование острой гипоксии достигалось путем помещения каждой рыбки в 5 или в 2,5 мл пресной воды, находящейся в герметичной емкости (внутри шприца) при определенной температуре в диапазоне 16-26°С, отличающейся от серии к серии на 1°С. Каждая рыбка находилась в воде внутри отдельного прозрачного пластикового инъекционного шприца при стабильной температуре. Определялась продолжительность жизни рыбок в условиях прекращения поступления атмосферного воздуха в воду, в которой находились рыбки. Помимо этого регистрировалась динамика двигательной активности рыб, в частности частота дыхательных движений жаберных дуг, частота открывания рта, частота и амплитуда колебаний плавников, а также последовательность изменения цвета плавников.
Перекись водорода вводилась в воду до или после помещения в нее рыбок с учетом двигательной активности рыбок, характерной для стадии их адаптации к гипоксии. Разовая доза перекиси водорода составляла 0,2 мл/кг рыбы.
Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы «Stastistica for Windows 5.0». Достоверность отличий определяли с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при P < 0,05. Данные представлены как M ± m (среднее ± стандартная ошибка среднего) [11].
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты проведенных экспериментов показали, что при прочих равных условиях продолжительность сохранения рыбок живыми в воде после прекращения поступления в нее атмосферного воздуха зависит от температуры воды и величины атмосферного давления. Установлено, что продолжительность жизни рыбок в герметичной емкости с водой тем дольше, чем ниже температура воды, и чем выше величина атмосферного давления в атмосферном воздухе.
Так, в серии опытов, проведенных в дни, когда атмосферное давление воздуха находилось в пределах 755-765 мм рт. ст., продолжительность жизни рыб в условиях прекращения поступления воздуха в воду зависит от температуры воды следующим образом: при температуре воды 26°С смерть рыбок породы голубые неоны и гуппи наступала соответственно через 25,3 ± 1,31 и 27,4 ± 1,32 минут (Р ≤ 0,05, n = 5), а при температуре воды 16°С смерть рыбок породы голубые неоны и гуппи наступала соответственно через 65,4 ± 2,60 и 67,6 ± 2,68 (Р ≤ 0,05, n = 5) минут после начала прекращения поступления воздуха в воду. Иными словами, понижение температуры воды на 10°С с уровня комнатной температуры удлиняет продолжительность жизни рыб при гипоксии в 2,2-2,3 раза.
В следующей серии опытов исследована продолжительность жизни рыбок в ограниченном объеме воды после прекращения поступления в нее атмосферного воздуха при различном атмосферном давлении. Опыты с рыбками проведены при температуре воды 16°С в дни, когда атмосферное давление воздуха было ниже или выше нормы на 10 мм рт. ст. При этом были получены следующие результаты. Продолжительность жизни рыбок из породы голубые неоны и гуппи при переживании ими гипоксии в воде при 16°С в дни, когда атмосферное давление находилось в пределах 770-780 мм рт. ст., была соответственно 67,3 ± 2,57 и 69,5 ± 2,62 минут, а в дни, когда атмосферное давление находилось в пределах 740-750 мм рт. ст. продолжительность жизни рыбок этих пород была соответственно 64,3 ± 2,50 и 65,8 ± 2,61 (Р ≤ 0,05, n = 5) минут.
Помимо этого выяснено, что в первый период адаптации к гипоксии рыбки практически неподвижны. Так, при нормальных значениях атмосферного давления (755-765 мм рт. ст.) и при температуре воды 26°С рыбки породы голубые неоны и гуппи остаются в неподвижном состоянии соответственно 21,90 ± 0,91 и 27,2 ± 0,95 минут (Р ≤ 0,05, n = 5), а при температуре воды 16°С сохраняют неподвижное состояние соответственно 49,7 3 ± 2,10 и 59,83 ± 2,22 минут (Р ≤ 0,05, n = 5). После этого неподвижность у рыбок исчезает. Вместо этого появляются активные движения жаберных дуг, плавников и туловища, рыбки непрерывно открывают рот и начинают усиленно пропускать воду через открытый рот и открытые жабры. Еще через 5-10 секунд после начала указанного периода двигательной активности рыбки начинают беспорядочно и резко перемещаться (метаться) в воде внутри емкости. При этом рыбы эпизодически испражняются, поэтому вода, в которой они плавают, загрязняется каловыми массами.
В целом указанный период высокой двигательной активность у рыб напоминает собой их судорожный поиск «лучшего» места внутри шприца (места, в котором вода содержит больше кислорода). Длится этот период в среднем 30-100 секунд, после чего рыбки замирают и вновь становятся неподвижными. При этом половина из них переворачивается кверху брюхом и всплывает кверху, оставшаяся часть рыб остается в положении вниз брюхом и опускается на дно. Однако после этого все рыбки еще около 1 минуты продолжают производить очень редкие дыхательные движения ртом и жаберными дугами, а также единичные подергивания плавниками, после чего окончательно становятся неподвижными и погибают. Перенос их тел в аэрируемую пресную воду не приводит к оживлению рыбок.
Полученные данные решено было принять за естественную устойчивость рыбок к гипоксии. Другими словами, описанные выше значения продолжительности жизни рыбок в герметичной емкости с водой были приняты за условную физиологическую норму, то есть за «контрольные данные», сравнение с которыми дает возможность выявлять изменение устойчивости рыбок к гипоксии, вызванное, например, применением антигипоксантов. Причем, исследуемые средства можно вводить прямо в воду, в которой плавают рыбки.
Выяснение данной возможности было исследовано в опытах с перекисью водорода. Дело в том, что перекись водорода является, по сути дела, химическим аккумулятором кислорода, из которого может образовываться с помощью каталазы молекулярный кислород. В частности, 100 мл раствора 6% перекиси водорода может выделить 1,97 л O2 (молекулярного кислорода) массой 2,816 г. Поэтому дополнение воды терапевтической дозой перекиси водорода теоретически должно отодвинуть момент наступления смерти рыб в воде при отсутствии поступления атмосферного воздуха в воду. И если такое удлинение длительности жизни аквариумных рыб будет обнаружено с помощью нашей модели острой гипоксии, то это будет означать, что модель пригодна для поиска веществ, обладающих антигипоксическим действием.
Нами были проведены химические расчеты, которые показали, что при введении в пресную воду с рыбами перекиси водорода в разовой дозе 0,2 мл/кг рыбы можно рассчитывать на следующее изменение содержания кислорода в этой воде. С одной стороны, можно сохранить в этой воде нормальный уровень растворенного в ней кислорода (что обеспечивается его содержанием в воздухе и величиной атмосферного давления), а с другой стороны дополнить воду связанным кислородом в количестве, достаточном в случае высвобождения из него растворенного кислорода для нормализации содержания кислорода в воде, лишенной кислорода.
Поэтому если использовать небольшой объем пресной воды (например, в объеме 5 мл), приготовленный для введения в нее аквариумной рыбки (массой около 0,3 г), ввести в этот объем перекись водорода в дозе 0,2 мл/кг рыбы, а затем измерить содержание в воде свободного и связанного кислорода, то будет выявлено увеличение суммарного количества кислорода практически в 2 раза. Это дает надежду на увеличение в 2 раза продолжительности жизни рыб в этой воде после прекращения поступления в нее атмосферного воздуха, если рыбы могут использовать связанный кислород, а точнее – перекись водорода.
Результаты проведенных нами экспериментов подтвердили правильность этих расчетов. Установлено, что для своевременного обеспечения рыбок кислородом и для достижения эффективного антигипоксического действия перекись водорода следует вводить в воду либо до помещения в нее рыб (то есть перед началом опыта с гипоксией), либо после помещения рыб в воду и начала прекращения доступа в нее кислорода, но не позднее 40 секунд после появления беспорядочной двигательной активности у рыб в конце адаптации их к гипоксии.
Оказалось, что в условиях нормального атмосферного давления и температуры воды в пределах 16°С введение перед началом эксперимента в воду с рыбками породы голубые неоны, переживающими острую гипоксии, перекиси водорода в дозе 0,2 мл/кг рыбы, позволяет продлить период сохранения их живыми с 49,73 ± 2,10 до 99,10 ± 4,70 минут, то есть практически в 2 раза.
Подобные же данные получены нами в опытах с рыбками породы гуппи и голубые неоны при гипоксии в условиях нормального атмосферного давления при более высокой температуре воды, а именно – при температуре воды 26°С. Показано, что в этих условиях перекись водорода в дозе 0,2 мл/кг рыбы также удлиняет период сохранения живых рыб. Так, рыбки породы голубые неоны и гуппи в контроле погибают через с 25,3 ± 1,31 и 27,4 ± 1,32 минут (Р ≤ 0,05, n = 5) (соответственно), а в опыте (под действием перекиси водорода) – через 52,43 ± 2,43 и 57,11 ± 2,45 минут (Р ≤ 0,05, n = 5) (также соответственно).
Кроме этого показано, что введение в воду с рыбками перекиси водорода в дозе, увеличенной в 4 раза, приводит к тому, что все 100% рыбок погибают через 5-12 минут после введения препарата.
Полученные результаты свидетельствуют, с одной стороны, о возможности использования аквариумных рыб для скрининга антигипоксантов в условиях острой гипоксии при различных температурных режимах, а с другой стороны – о способности перекиси водорода и холода эффективно отодвигать момент наступления смерти рыб при гипоксии, что может найти применение при хранении и транспортировке живой рыбы.
Таким образом, нами разработан способ поиска веществ, изменяющих устойчивость организма к острой гипоксии, то есть способ скрининга гипоксантов и антигипоксантов.
Библиографическая ссылка
Ураков А.Л., Ураков А.Л., Ураков А.Л., Уракова Н.А., Чернова Л.В. СПОСОБ СКРИНИНГА АНТИГИПОКСАНТОВ // Успехи современного естествознания. – 2014. – № 9-1. – С. 24-27;URL: https://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=34181 (дата обращения: 19.04.2024).