Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,775

SYNTHESIS AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF O,O-DIMETYL-N-CYTISINILPHOSPHAT

Kabieva S.K. 1 Nurkenov O.A. 2 Bakibaev A.A. 3 Gazaliev A.M. 1 Takibaeva A.T. 1 Voronova O.A. 3 Plotnikov E.V. 3 Isaeva A.Z. 2
1 Karaganda State Technical University
2 Organic synthesis and carbon chemistry Institute Republic of Kazakhstan
3 Tomsk Polytechnic University
2688 KB
Electrochemical properties and influence on oxygen electroreduction process of O,O-dimetyl-N-cytisinilphosphate (cytaphat) at various concentrations have been investigated in this work. Cathodic voltammetry on a mercury film electrode was applied as an estimation method. Voltammetric approach reflects the amount of active oxygen radicals being scavenged by the antioxidants within certain time. It was revealed, cytaphat exhibits antioxidant properties in water solution.
O
O-dimetyl-N-cytisinilphosphate
antioxidant activity
voltammetry
oxygen electroreduction (ER O2)

Известно, что в результате метаболических превращений веществ в организме человека образуются токсичные свободные радикалы кислорода [1]. Они образуются в реакциях перекисного окисления липидов, при метаболизме различных препаратов, воздействии внешних факторов (действие ультрафиолета, ионизирующее облучение). Образовавшись в организме, они вступают во взаимодействие со структурами клетки, приводя в конечном счете к поражению мембран клеток, сопутствуя, таким образом, развитию патологического процесса при многих заболеваниях. В норме регуляция продукции активированных кислородных метаболитов и свободных радикалов в тканях и органах человека осуществляется многоуровневой физиологической антиоксидантной системой, которая включает в себя соединения различной химической природы: витамины, пигменты, гормоны, ферменты [2]. Несмотря на высокую эффективность антиоксидантной системы, она не всегда способна защитить организм человека от развития оксидантного стресса. В связи с этим одним из приоритетных направлений свободнорадикальной биохимии и медицины является создание препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами, с целью применения их для профилактики и лечения заболеваний, сопровождающихся усилением свободнорадикальных реакций. Широкие перспективы для практического использования в качестве лекарственных препаратов антиоксидантного действия представляют биологически активные вещества природного происхождения, например вещества алкалоидов хинолизидинового ряда. Интерес к исследованиям по химической модификации и свойствам алкалоида цитизина обусловлен широким спектром биологической активности производных цитизина [3, 4]. В этой связи получение новых производных алкалоида цитизина, исследование их структуры и фармакологической активности является актуальной задачей современной химии и медицины.

Цель исследования

Осуществить синтез и изучить антиоксидантную активность О,О-диметил-N-цитизинилфосфата (цитафата) в отношении кислородных радикалов методом катодной вольтамперометрии.

Материалы и методы исследования

ИК спектр снимали на спектрометре с Фурье-преобразователем AVATAR-320 Nicolet в таблетках с KBr. Спектр ЯМР1Н записан на спектрометре Bruker 400 (400 МГц) в растворе ДМСО-d6 относительно внутреннего стандарта – ТМС. Температуру плавления вещества определили на приборе Boetius.

Синтез О,О-диметил-N-цитизинилфосфата. К смеси 2,86 г диметилфосфита и 24,6 г четыреххлористого углерода в 100 мл абсолютного бензола прикапывали при температуре 0–10 °С смесь 5 г цитизина и 2,63 г триэтиламина в 100 мл абсолютного бензола. Затем смесь перемешивали в течение 5 ч при комнатной температуре. Отфильтровывали и промывали гидрохлорид триэтиламина, отгоняли растворитель. Получили 5,6 г (72,1 %) продукта (перекристаллизация из бензола) с т.пл. 156 °С.

Исходные растворы исследуемых веществ с концентрацией 0,1 г/мл готовили следующим образом: на аналитических весах взвешивали 0,5 г образца и растворяли в 5 мл. Далее растворы с концентрацией 0,01 г/мл и 0,001 г/мл готовили последующим разбавлением дистиллированной водой в пенициллиновых флаконах объемом 10 мл.

Для исследований брали объем аликвоты 0,1 мл, соответственно концентрация исследуемых растворов представлена в таблице.

Методика эксперимента заключалась в съемке вольтамперограмм катодного ЭВ О2 с помощью вольтамперометрического анализатора, подключенного совместно с ПК [5]. Использовался постоянно-токовый режим катодной вольтамперометрии, скорость развертки потенциала W = 30 мВ/с, рабочий диапазон потенциалов от 0,0 до – 0,7 В, время перемешивания раствора 20 сек, время успокоения 10 сек. Электрохимическая ячейка представляла собой стеклянный стаканчик с раствором фонового электролита и опущенными в него индикаторным ртутно-пленочным электродом, хлорид-серебряным электродом сравнения и хлорид-серебряным вспомогательным электродом. В качестве фонового раствора выбран фосфатный буфер с рН 6,86, близким к физиологическому значению, объемом 10 мл.

Результаты исследования и их обсуждение

С целью поиска и изучения свойств новых биоактивных веществ на основе алкалоида цитизина нами осуществлен синтез О,О-диметил-N-цитизинилфосфата (цитафата) в условиях реакции Тодда-Атертона. Синтез O,O-диметил-N-цитизинилфосфата осуществляли взаимодействием О,О-диметилфосфита с цитизином в среде абсолютного бензола в присутствии четыреххлористого углерода и триэтиламина по следующей схеме:

kabievaS1.wmf

Синтезированный целевой продукт представляет собой белое кристаллическое вещество, легко растворим в воде, спирте, ацетоне и хлороформе, практически не растворим в эфире.

В ИК спектре данного соединения присутствуют интенсивные полосы поглощения, характерные для фосфорильной группы (Р=О) при 1265–1270 см-1, а в области 1025–1050 см-1 – для Р-О-С-группы.

При анализе ЯМР1Н спектра цитафата три группы сигналов низкого поля соответствуют протонам α-пиридинового ядра. Сигналы при 7,30 м.д. соответствуют β-протону. Расщепленный дублет при 6,09 м.д. соответствует γ-протону, а расщепленный дублет при 6,36 м.д. – α-протону. Следующая группа линий, представляющая собой сложный сигнал в области 3,81–4,12 м.д., соответствует аксиальному и экваториальному протонам в положении С10. Эта группа сигналов является АВ-частью системы АВХ, где Х – протон в положении С9. Экваториальный протон при С10 смещен в более слабое поле по сравнению с аксиальным. Группа линий в области 3,52–3,60 м.д. представляет собой сигналы пяти протонов, находящихся при С11, С13, и третичного протона С7. Протоны метокси-группы у атома фосфора неэквивалентны, и они проявляются в области 3,30 и 3,44 м.д. в виде двух расщепленных дублетов. Два третичных протона в положениях С7 и С9 у метиленового мостика не эквивалентны, так как протон при С7 находится в α-положении к двойной связи и подвержен влиянию анизотропии к ней, вследствие чего смещен в более слабое поле (δ 3,03–3,10 м.д.) относительно протона С9. А широкий сигналет в области 2,43 м.д. принадлежит протону С9. Группа линий в области 1,91–2,03 м.д. относится к протонам при С11 и С13.

Продолжая исследования фармакологической активности О,О-диметил-N-цитизинилфосфата, изучили его антиоксидантную активность с применением вольтамперограмм катодного ЭВ О2 с помощью вольтамперометрического анализатора при различных концентрациях.

Активность образцов определяли, используя метод катодной вольтамперометрии, в частности процесс электровосстановления кислорода (ЭВ О2). Модельная реакция ЭВ О2 протекает на электроде по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в тканях и клетках организма:

О2 + е kab01.wmf О2˙- (1)

О2˙- + Н+ kab02.wmf HO2˙ (2)

HO2˙ + Н+ + е- kab03.wmf Н2О2 (3)

Н2О2+ 2Н+ + 2е- kab04.wmf2О (4)

В данном случае рассматривается первая волна ЭВ О2 (восстановление кислорода до пероксида водорода) с образованием активных кислородных радикалов: О2-, НО2 (выражения 1–3). Предполагается, что вещества реагируют с кислородом и его активными радикалами на поверхности индикаторного электрода, что отражается в изменении катодного тока ЭВ О2 [6].

Активность исследуемого вещества по отношению к ЭВ О2 определялась по следующей методике: снимались вольтамперограммы тока ЭВ О2 в отсутствии исследуемого вещества (фоновая кривая) по описанному выше способу. При отсутствии посторонних пиков фоновый раствор считался чистым. Затем в ячейку добавлялось исследуемое вещество с известной концентрацией (брали объем аликвоты 0,1 мл на 10 мл объема фонового электролита) и снималась катодная вольтамперограмма ЭВ О2 при тех же условиях. Измерения повторялись не менее 3 раз через определенный промежуток времени (180 с) и каждый раз оценивалось значение предельного тока ЭВ О2.

Изменение тока ЭВ О2 по своему абсолютному значению свидетельствует о том, что исследуемые образцы реагируют с кислородом и его активными радикалами в исследуемом растворе. Степень изменения тока ЭВ О2 являлась показателем активности исследуемого образца.

По полученным данным строилась зависимость относительного изменения тока ЭВ О2 kabiev01.wmf от времени протекания процесса в присутствии одной концентрации исследуемого образца.

По линейной части графика и по тангенсу угла наклона касательной к данному участку кривой рассчитывался коэффициент активности образцов – K, мкмоль/(л×мин) по формуле:

kab05.wmf, (5)

где Со2 – концентрация кислорода в исходном растворе без вещества, мкмоль/л;

Ii – текущее значение предельного тока ЭВ О2, мкА;

Iо – значение предельного тока ЭВ О2 в отсутствии вещества в растворе, мкА;

t – время протекания процесса, мин.

Для исследуемого вещества получена однотипная вольтамперограмма, наблюдалось уменьшение катодного тока ЭВ О2, что свидетельствует о проявлении ими антиоксидантной активности по отношению к данному процессу. Кроме того, наблюдался сдвиг потенциала катодного тока ЭВ О2 в положительную область потенциалов. Все вышесказанное предполагает наличие механизма ЕС (электрохимическая – химическая стадии), который включает последующую химическую реакцию взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными радикалами.

При этом общая схема электродного процесса с последующими химическими реакциями взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными радикалами будет выглядеть следующим образом:

kabievaS2a.wmf

Антиоксидантная активность О,О-диметил-N-цитизинилфосфата по отношению к ЭВ О, с различной концентрацией (n = 5, p = 0,95)

Концентрация вещества

Среднее значение, K, мкмоль/л мин

Стандартное отклонение, S

Относительное стандартное отклонение, Sr

Стандартное отклонение среднего, Sx

Доверительный интервал, δ

0,00001 г/мл

0,183

0,032

0,174

0,019

0,05

0,0001 г/мл

0,280

0,012

0,043

0,007

0,02

0,001 г/мл

0,399

0,045

0,113

0,026

0,07

Антиоксидантную активность определяли, используя выражение (5) (см. таблицу).

Выводы

Осуществлен синтез и изучено влияние О,О-диметил-N-цитизинилфосфата на процесс электровосстановления кислорода в различных концентрациях. В качестве метода оценки применена катодная вольтамперометрия на ртутно-пленочном электроде. В данном подходе определение антиоксидантной активности отражало количество активных форм кислорода, нейтрализованных антиоксидантом за определенное время. Показано, что водный раствор цитафата проявляет антиоксидантную активность.

Эксперименты выполнены при поддержке гранта РФФИ, проект № 15-04-01110.